Quantitative detection of Human Cytomegalovirus antigen pp65 by flow cytometry

Die Zytomegalieviruserkrankung stellt noch immer eine der wichtigsten Ursachen von Mortalität und Morbidität bei Immunsupprimierten wie z. B. Transplantatempfängern dar. Das derzeitig favorisierte Therapiekonzept sieht eine präemptive Therapie vor, die nur bei Patienten eingeleitet wird, bei denen eine Virusreplikation frühzeitig nachgewiesen werden kann, die aber noch nicht klinisch erkrankt sind. Der derzeit bestetablierteste diagnostische Parameter hierzu ist der Nachweis des CMV-Antigens pp65 in Leukozyten. Der konventionelle Nachweis von pp65 ist allerdings aufgrund der subjektiven Auswertung nicht standardisierbar. Ziel der hier vorgestellten Arbeit war es, den pp65-Nachweis mittels Durchflußzytometrie zu vereinfachen und die CMV-Routinediagnostik durch die Etablierung dieser Methode zu optimieren und zu standardisieren. Zur Methodenevaluierung wurden insgesamt 214 Messungen von 110 immunsupprimierten Patienten durchgeführt. Es galt die Testsensitivität sowie die –spezifität der FACS-Analyse im Vergleich mit dem konventionellen pp65-Antigenämie-Test und der quantitativen CMV-DNA-Analyse zu ermitteln. Es konnte ein optimierter Grenzwert ab vier pp65-positiven Zellen aus insgesamt 100.000 detektierten Leukozyten im FACS ermittelt werden. Für diesen Wert errechnete sich eine Testsensitivität von 77,5 % und eine –spezifität von 84,6 %. In der Gegenüberstellung der drei Vergleichsteste ergab sich, bezogen auf die qualitativen Ergebnisse, für Proben, bei denen mindestens in einer der Methoden CMV Replikation nachgewiesen werden konnte, zwischen der Durchflußzytometrie und dem pp65-Antigenämie Test eine höhere Übereinstimmung (50,5 %) als mit der CMV-DNA Bestimmung (44,1 %). Letztendlich lässt sich sagen, dass die neue Methode, die deutlich weniger Ausgangsmaterial braucht, schneller und objektiver ist als der konventionelle pp65-Nachweis. Jedoch müsste das Verfahren aufgrund des im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Mangels an Sensitivität und Spezifität durch weitere Variationen im Bearbeitungsprotokoll oder der Auswertung, z. B. durch die Miteinbeziehung einer vergleichbar großen Kontrollgruppe CMV-seronegativer Patienten oder Blutspender weiter optimiert werden.Cytomegalovirus is a major cause of morbidity and mortality in immunosuppressed patients such as transplant recipients. At present, pre-emptive administration of antiviral drugs is the dominant principle of therapy, defined by early initiaton of therapy at the moment when virus replication is detected, but importantly before symptoms develop. To date, the detection of the CMV antigen pp65 in leucocytes is the best established diagnostic tool for this purpose. However, detection of pp65 with the established slide technique lacks standardization as reading of the slides is subjective. The aim of this study was to simplify pp65 detection by using flow cytometry for reading and thus to establish an optimized and more standardized method. Sensitivity and specificity of the newly established flow cytometry detection was compared with the pp65 detection in the conventional slide technique and with a quantitative CMV-DNA detection by the hybrid capture test in 214 sampled from 100 immunosuppressed patients. A methodological cut-off value of 4 positive cells in 100.000 cells was established for flow cytometry. Using this cut-off sensitivity and specificity were 77, 5 % and 84,6 %, respectively. In a comparison all three assays with samples, in which at least one assay detected CMV replication the correlation of qualitative results between the two pp65 methods was 50,5 %. However, correlation between the flow cytometry and the CMV-DNA detection was lower with 44,1 %. In conclusion the newly established method is a more rapid and objective technique and requires significantly less input volume compared to the conventional slide technique. However, at present a substantial lack of sensitivity and specificity implies that this protocol should be modified to overcome these problems. Moreover, further studies including other patients such as blood donors or CMV-negative individuals might improve the evaluation