Nachweis der Expression leukozytärer Zytokine im Corpus luteum der Hündin zu definierten Stadien im Diöstrus

Im Gegensatz zu anderen Spezies sind beim Hund die die Luteolyse steuernden Mechanismen noch weitgehend unklar. Dazu durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, dass zumindest bei der ingraviden Hündin und anders als z.B. bei den landwirtschaftlichen Nutztieren, die Luteolyse nicht durch ein uterines Luteolysin (PGF2alpha) initiert wird. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Lutealfunktion und insbesondere die luteale Regression bei der Hündin parakrinen und/oder autokrinen Steuerungsmechanismen unterlegen ist. Sowohl der immunhistologische Nachweis als auch der Nachweis der Expression der mRNA von Progesteron- und Östrogenrezeptoren im CL der Hündin haben erstmals eine solche Rolle für luteales Progesteron und Estradiol-17beta erkennen lassen. Ebenso konnte in vorausgehenden Untersuchungen der immunhistologische Nachweis von CD4- und CD8-positiven T-Lymphozyten sowie von MHC Klasse II exprimierenden Makrophagen im CL der Hündin nachgewiesen werden. Dabei wurde ein Anstieg der CD8-positiven Population sowie der MHC Klasse II exprimierenden Population zum Zeitpunkt der einsetzenden Luteolyse beobachtet. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit die Expression der von diesen Immunzellen sezernierten Zytokine ermittelt werden. Um erste Erkenntnisse über das Expressionsmuster von Zytokinen im CL der Hündin zu gewinnen, wurde dabei ein breites Spektrum an Zytokinen zu definierten Zeitpunkten im Diöstrus im Rahmen ansteigender und wieder abfallender Progesteronkonzentrationen mittels RT-PCR untersucht. Dazu wurden jeweils 5 Hündinnen an den Tagen 5, 15, 25 und zwischen dem 60.-80. Tag sowie jeweils 4 Hündinnen an den Tagen 35 und 45 nach der Ovulation einer Ovariohysterektomie unterzogen. Die Corpora lutea wurden möglichst vollständig vom umgebenden Ovargewebe separiert, in Tissue Tec bzw. RNAlater eingebettet und bei –80°C gelagert. Die komplette RNA wurde mit Trizol Reagent isoliert und einer Behandlung mit DNase unterzogen, um Rückstände genomischer DNA zu eliminieren. Danach wurde die RNA unter Verwendung des RNA PCR Core Kit (Perkin Elmer) in cDNA umgeschrieben und anschließend unter Verwendung spezifischer caniner Primer für IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma und TGF-beta1 amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%igem Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, sichtbar gemacht. Als Positivkontrolle diente RNA von mit Con A stimulierten caninen Leukozyten und das „Housekeeping Gene“ GAPDH. Als Negativkontrolle wurde Wasser anstelle von RNA mitgeführt, um eine Kontamination der Lösungen auszuschließen. Zur Bestätigung der Ergebnisse wurde die Untersuchung aller Proben nochmals wiederholt und durch Sequenzierung ausgewählter PCR-Produkte zusätzlich abgesichert. Die mRNA der Zytokine IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alpha und TGF-beta1 wurde mit gewissen individuellen und experimentell bedingten Variationen weitgehend unabhängig vom Untersuchungstag in beiden Versuchdurchläufen relativ konstant exprimiert. Die Expression von TNF-alpha stellte sich dabei visuell im Vergleich zur Expression von IL-8, IL-10, IL-12 und TGF-beta1 insgesamt etwas schwächer dar. Die Untersuchungen zur Expression der mRNA von IL-4 ergaben in allen Proben eindeutig negative Ergebnisse. Entsprechend negativ verliefen die Untersuchungen zur Expression der mRNA von IL-1beta und IL-2, wobei der Erhalt unspezifischer Amplifikate eine abschließende Interpretation allerdings nicht erlaubt. Die Ergebnisse der Untersuchung zur Expression der mRNA von IL-6 und IFN-gamma sind heterogen. So gelang der Nachweis bei einem Teil der Proben im 1. Versuchsdurchlauf, nicht mehr jedoch im 2. Versuchsdurchlauf. Nachdem die Richtigkeit des Amplifikates für IFN-gamma durch Sequenzierung bestätigt wurde, muss derzeit davon ausgegangen werden, dass die Expression beider Zytokine auf so niedrigem Niveau verläuft, dass ihre Detektion an der Empfindlichkeitsgrenze des angewandten PCR-Verfahrens ist, insbesondere wenn im Rahmen des „Probenhandling“ mRNA verloren geht. Insgesamt gesehen scheinen die Untersuchungsergebnisse jedoch auf eine eher untergeordnete Rolle von IL-6 und IFN-gama im CL der Hündin hin zu deuten. Die in vorliegender Untersuchung dargestellte Expression der mRNA von IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alpha und TGF-beta1 im CL der Hündin suggeriert, dass diese Zytokine eine möglichercherweise modulatorische Funktion bei der Differenzierung, Aufrechterhaltung und Regression des CL besitzen könnten. Aus der Literatur ist bekannt, dass IL-10 als luteotroper Faktor die Progesteronproduktion fördert, während TGF-beta1 sowohl luteotrope als auch luteolytische Eigenschaften zugesprochen werden. Wie TGF-beta1 scheint auch TNF-alpha die Differenzierung der Lutealzellen in der frühen Lutealphase zu fördern, während es in der späten Lutealphase die Apoptose durch zytotoxische Effekte zu induzieren scheint. Die Wirkung von IL-8 wird hauptsächlich in der Förderung der Angiogenese des sich entwickelnden CL gesehen. Diese bei anderen Spezies gemachte Beobachtungen jedoch auf Vorgänge im CL bei der Hündin zu übertragen, wären zum gegenwärtigen Zeitpunkt rein spekulativ. Daher sind weitere Untersuchungen, z.B. in einem geeigneten in vitro-System oder der Nachweis des Bildungsortes der Zytokine im CL mittels Immunhistochemie notwendig, um die Ergebnisse weiter zu verifizieren. Mangels geeigneter Antiseren konnten in vorliegender Arbeit diesbezügliche Ergebnisse nicht erhalten werden.Luteolysis in the dog is still poorly understood and different to other domestic animal species. At least in nonpregnant bitches luteolysis is not initiated by a luteolytic agent (PGF2alpha) secreted from endometrium. It was therfore postulated that parakrine and/or autokrine regulatory mechanisms are involved in luteal regression in the dog. Detection of progesterone- and estrogenreceptors in the CL of the dog on the protein- and mRNA-level have first indicated such a role for luteal progesterone and estradiol-17beta. Preceeding immunohistological investigations have demonstrated the presence of CD4- and CD8-positive T-lymphocytes and also of MHC class II antigen positive cells in the CL of the bitch with an increase in the population of the CD8-positive and MHC class II positive cells towards luteolysis. The present investigation were therefore designed to detect by means of RNA-technology the expression of a broad spectrum of cytokines possibly secreted by these cells during the course of diestrus covering the periods of increasing and decreasing progesterone concentrations. Five bitches were ovariohysterectomised on days 5, 15, 25 and between days 60-80 after ovulation and 4 bitches on days 35 and 45 respectively. The corpora lutea were separated from surrounding ovarian tissue, embedded in Tissue Tec or RNAlater and stored at -80°C. Total RNA was isolated using Trizol Reagent and treated with DNase to eliminate genomic DNA. RNA was translated in cDNA using the RNA PCR Core Kit (Perkin Elmer) and then amplified with canine specific primers for IL-1 beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-a, IFN-gamma and TGF-beta1. The amplicons were visualised on a 2% ethidium bromide stained agarose gel. RNA isolated from canine leukocytes stimulated with Con A and the “housekeeping gene” GAPDH were used as positive controls. To exclude contamination of solutions, water was used as a negative control instead of RNA. For confirmatory purposes each sample was investigated a second time; the results were additionally confirmed by sequencing selected samples of positive PCR-products for each cytokine. The expression of mRNA for IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alpha and TGF- beta 1 could be detected in all samples during the course of diestrus in both experimental runs without any obvious variations. Expression of TNF-alpha mRNA seemed to be weaker than expression of mRNA for IL-8, IL-10, IL-12 or TGF-beta 1. All tests for the expression of IL-4 were clearly negative. Also the expression of the mRNA of IL-1beta and IL-2 could not be detected although some unspecific amplicons showed up. Results concerning the expression of IL-6 and IFN-gamma mRNA were ambiguous. Thus expression of IL-6 mRNA was clearly shown in 5 samples during the first run; however, results were negative during the second run performed several months later. Similary expression of IFN-gamma mRNA could only be demonstrated during one run. Based on the accuracy of the controls run in each assay it is assumed that expression of these two cytokines is at the lower limit of detection of the applied mRNA assay, particularly if a loss of mRNA is considered during the thawing and freezing procedures. In summary the importance of IL-6 and IFN-gamma in the CL of the bitch rather seems to be negligeable. The expression of mRNA for IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alpha and TGF- beta1 suggests that they may have a modulatory function in differentiation, maintenance and regression of the canine CL. Other studies have shown that IL-10 acts as a luteotrophic agent by promotion of progesterone production while TGF- beta1 seemed to have luteotrophic as well as luteolytic properties. Similarly TNF-alpha seems to promote the differentiation of luteal cells in the earlier phases of diestrus while it induces apoptosis by cytotoxic effects in late diestrus. IL-8 seems to be mainly involved in promotion of angiogenesis by reorganising the CL in the early luteal phase. These observations may also apply to the canine CL. However, at present this remains merely speculative. Hence further investigations are necessary which should also include adequate in vitro systems and methods allowing the identification of the cytokine-producing cells. Due to the lack of adequate antisera the latter information could not be obtained during the course of these studies