Generation of a transgenic mouse model for cutaneous carcinogenesis by Epidermodysplasia verruciformis associated human papillomaviruses

Die ätiologische Bedeutung von Papillomviren beim Zervixkarzinom des Menschen, beim Ösophaguskarzinom des Rindes und beim equinen Sarkoid ist akzeptiert. Eine Rolle Epidermodysplasia verruciformis (Ev)-assoziierter humaner Papillomviren HPV) bei der Entstehung von Hautkrebs wird vermutet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für kutane Onkogenese durch HPV8 generiert. Dabei wurde die gesamte frühe Genregion von HPV8 unter Kontrolle des humanen Keratin 14-Promotors in das Genom des Mausstamms DBA/Bl6 integriert. Im weiteren Verlauf wurde über fünf Generationen sukzessive in den genetischen Hintergrund der Mausstämme FVB/N bzw. Bl6 rückgekreuzt. Bei keiner der HPV8-Transgen-negativen Mäuse wurden Veränderungen in der Haut oder einem anderen Organsystem beobachtet. Im Gegensatz dazu entwickelten mehr als 50% der HPV8-transgenen Mäuse, teils multifokal, benigne Tumoren, welche durch Alopezie,Hyperplasie, Hyperkeratose und Ulcera gekennzeichnet waren. Die Tendenz zur Tumorentwicklung korrelierte mit den Transgenlasten. Bei drei von bisher 20 obduzierten Mäusen (15%) konnten histologisch Plattenepithelkarzinome nachgewiesen werden. Damit wurde erstmals experimentell das kanzerogene Potential eines Ev-assoziierten HPV-Typs in vivo gezeigt. Mittels neu etablierter quantitativer Echt-Zeit-RT-PCR für die HPV8-Gene E2, E6 und E7 wurde die Expression des Integrats bestätigt. Die höchsten Expressionsspiegel wurden für E2 gefunden, gefolgt von E7 und E6, wobei diese in benignen Tumoren 10-30-fach höher lagen als in unauffälliger angrenzender Haut. Bei einer Maus mit malignem Tumor waren die Expressionsspiegel im Karzinom und in unauffälliger Haut vergleichbar, lagen aber um den Faktor 10-50 höher als in unauffälliger Haut von Mäusen mit benignen Tumoren. Während beim Hautkrebs des Menschen häufig UV-induzierte Mutationen im Tumorsuppressorgen p53 vorkommen, konnten mittels PCR und anschließender Sequenzanalyse weder in benignen noch in malignen Tumoren Mutationen in den p53-Exons 4-9 des Mausgenoms gezeigt werden. Die Beobachtung, dass die Expression viraler Gene im Mausmodell für die Entwicklung von nicht-melanozytären Hauttumoren ausreichend ist, unterstreicht das hohe onkogene Potential von HPV8. Die in dieser Arbeit etablierten HPV8-transgenen Mauslinien sind ein wertvolles Modell für Untersuchungen der Funktionen früher Gene von HPV8 in vivo und die Entwicklung antiviraler Strategien.The etiologic role of papillomaviruses in human cervical carcinoma, bovine oesophageal carcinoma and equine sarcoid is accepted. A role of Epidermodysplasia verruciformis (Ev)-associated human papillomaviruses (HPV) in the development of skin cancer is suspected. In this work a transgenic mouse model for cutaneous oncogenesis by HPV8 was generated. The complete early region of HPV8 under the control of the human keratin 14-promoter was integrated into the genome of DBA/Bl6 mice. Transgenic mice were crossbred over five generations with FVB/N and Bl6 mouse strains. None of the HPV8-transgene negative mice developed lesions of the skin or any other organ. In contrast, more than 50% of HPV8-transgenic mice developed partially multifocal, benign tumours which were characterized by alopecia, hyperplasia, hyperkeratosis and ulcers. The tendency for tumour development correlated with transgene loads. For three out of twenty (15%) post mortem examined mice histology revealed squamous cell carcinomas. This is the first experimental proof of the carcinogenic potential of an Ev-associated HPV-type in vivo. Via newly established real-time-RT-PCR protocols for HPV8-genes E2, E6 and E7 the expression of the integrate was confirmed. Highest expression levels were found for E2, followed by E7 and E6 with 10-30 fold higher levels in benign tumours compared to adjacent skin without pathological findings. In a mouse with a malignant tumour expression levels were comparable in the carcinoma and the skin without pathological findings, however, the levels were 10-50-fold higher than in normal skin of mice with benign tumours. Whereas UV induced mutations in the tumour suppressor gene p53 are frequently detected in human skin carcinomas, mutations in p53 exons 4-9 via PCR and sequence analysis were observed neither in benign nor in malignant tumours. The notion, that the expression of viral genes in the mouse model is sufficient for the development of non-melanoma skin cancer underlines the high oncogenic potential of HPV8. The transgenic mouse-strains provide a valuable model for investigations of the functions of the early genes of HPV8 in vivo and for the development of antiviral strategies