Occurrence of vancomycin resistant enterococci (VRE) isolated from poultry and pork

Enterokokken gehören zu den häufigsten nosokomialen Infektionserregern Harnwegs- und Wundinfektionen, Sepsis, Endocarditis). Die zunehmende Resistenzentwicklung bei Enterococcus (E.)-Stämmen vor allem gegen die Glycopeptidantibiotika Vancomycin (gebildet von Amycolatopsis orientalis) und Teicoplanin (gebildet von Actinoplanes teichomyceticus) ist Grundlage für intensive Untersuchungen. Die Anwendung des Fütterungsantibiotikums Avoparcin wurde aufgrund des Verdachtes, dass dessen Verwendung in der Tiermast zur Entwicklung von Kreuzresistenzen gegen diese Antibiotika bei Enterokokken führt, in Deutschland im Januar 1996 und in der EU im April 1997 untersagt. In eigenen Untersuchungen sollten Enterokokken aus 115 Geflügel- und 50 Schweinefleischproben auf dem CATC-Agar (Citrat Azid Tween Carbonat Agar) isoliert und zunächst einer orientierenden Überprüfung auf Vancomycin-Resistenz auf dem Co-lumbia CNA Agar (Colistin Nalidixin Azid Agar, supplementiert mit 5% Schafblut und 5 mg Vancomycin/l) unterzogen werden. Klinische Isolate und Referenzstämme wurden in den Untersuchungen einbezogen. Von 1691 E.-Isolaten aus den Geflügel- und Schweinefleischproben konnten mithilfe des Vancomycin-supplementierten Columbia CNA Agar 420 Isolate als Vancomycin-resistent identifiziert werden. Alle 420 als resistent identifizierten E. Isolate wurden mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit spezifischen Primern zum Nachweis der Vancomycin-Resistenz-vermittelnden van-Gene untersucht (\u27high level\u27: vanA; \u27moderate-high level\u27: vanB; \u27low level\u27: vanC1, vanC2 und vanC3). Die Spezifität der van-Gen-typischen Amplifikate wurde mithilfe der Restriktionsanalyse unter Verwendung der CfoI- (vanA) und DdeI- (vanB) Endonucleasen überprüft. Für die intraspezifische Differenzierung vanA-positiver VRE-Isolate wurde für die Randomly Amplified Poly-morphic DNA-Methode (RAPD) der Primer \u27kay3\u27- und für die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) die Restriktionsendonuclease SmaI verwendet. Das vanA-Gen konnte bei 203 Isolaten (127 E. faecium, 31 E. faecalis, 34 E. durans, 10 E. hirae und ein E. gallinarum) aus 50 (43,5%) Geflügelfleischproben, in keinem Fall bei Isolaten aus Schweinefleischproben nachgewiesen werden. Das vanB-Gen konnte in keinem Fall ermittelt werden. Das vanC1-Gen konnte bei 39 E. gallinarum-Isolaten aus 24 (20,7%) Geflügel-fleischproben und einer Schweinefleischprobe (2,0%) nachgewiesen werden. Dabei war ein E. gallinarum-Isolat vanA- und vanC1-Gen-positiv. Das vanC2-Gen konnte bei einem E. flavescens- und 22 E. casseliflavus-Isolaten aus 12 (10,4%) Geflügel-fleischproben und vier (8,0%) Schweinefleischproben nachgewiesen werden. Das vanC3-Gen konnte bei einem E. flavescens- und acht E. casseliflavus-Isolaten aus zwei (1,7%) Geflügelfleischproben und drei (6,0%) Schweinefleischproben nach-gewiesen werden. Dabei war ein E. flavescens- und acht E. casseliflavus-Isolate vanC2- und vanC3-Gen-positiv. VanC-positive VRE konnten in 33 Geflügel- (28,7%) und fünf Schweinefleischproben (10,0%) nachgewiesen werden. Davon konnten aus 14 Geflügelfleischproben VRE isoliert werden, die das vanA- und das vanC-Gen besitzen. Alle Enterokokken, bei denen das vanA-Gen nachgewiesen werden konnte, wurden mit der RAPD- und der PFGE-Methode einer Feintypisierung unterzogen. Die RAPD stellte sich in Verbindung mit der DNA-Isolierung mit dem QIAamp Tissue Kit in der vorliegenden Arbeit als ein zuverlässiges und reproduzierbares Verfahren für die Feintypisierung inter speciem heraus. Es konnten die biochemisch identifizierten Spezies E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. casseliflavus und E. gallinarum mithilfe des universellen Primers \u27kay3\u27 jeweils einem spezifischen Bandenmuster zugeordnet und demnach eindeutig identifiziert werden. Die Untersuchungen mit der PFGE zeigen, dass aus dem humanmedizinisch-klinischen Bereich stammende Isolate von denen aus Lebensmitteln deutlich abzu-grenzen sind. Zudem sind die Enterokokken durch eine beachtliche genotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die Ergebnisse der PFGE-Untersuchungen und die Ähnlichkeiten der Feintypisierungs-Bandenmuster einiger Enterococcus-Isolate konnten anhand von Dendrogrammen dokumentiert werden. Es zeigt sich, dass die größte Übereinstimmung der SmaI-Restriktionsmuster zwischen den Isolaten aus Geflügelfleisch und den klinischen Isolaten bei 78% liegt. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Lebensmittel tierischen Ursprungs durch den Einsatz von Fütterungsantibiotika in der Tiermast als weitere Quelle für die Resistenz-Entwicklung angesehen werden müssen. Auch nach dem Avoparcin-Verbot sind weiterhin VRE-Stämme nachzuweisen.Enterococci belong to the most frequent nosocomial infection exciters (urinary tract and wound infections, sepsis, endocarditis). The increasing resistance development in Enterococcus (E.) strains particularly against the glycopeptides antibiotics vancomycin (produced by Amycolatopsis orientalis) and teicoplanin (produced by Actinoplanes teichomyceticus) is basis for intensive investigations. The application of the feeding antibiotic avoparcin was forbidden due to the suspicion that its use leads in the animal mast to the development of cross-resistances against these antibiotics with enterococci, in Germany since January 1996 and in the European Union since April 1997. In own examinations from 115 poultry and 50 pork samples, enterococci were isolated on the CATC agar (Citrate Azide Tween Carbonat agar) and submitted first of an orienting examination on vancomycin resistance on the Columbia CNA agar (Colistin Nalidixin Azide agar, supplemented with 5% sheep blood and 5 mg vancomycin/l). Clinical Isolate and reference strains were included in the investigations. Out of 1691 E.-isolates from poultry and pork samples 420 isolates could be identified as vancomycin resistant using vancomycin supplemented Columbia CNA agar. All 420 as resistant identified E. isolates were examined with the polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for the proof of the vancomycin resistance obtaining van genes. (\u27high level\u27: vanA; \u27moderate high level\u27: vanB; \u27low level\u27: vanC1, vanC2 and vanC3). The specificity of the van gene typical amplicons was proved by restriction analysis using CfoI (vanA) and DdeI (vanB) endonucleases. For the intraspecific differentiation of vanA positive VRE Isolate we used for the randomly amplified polymorphic DNA method (RAPD) the primer \u27kay3\u27- and for the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) the restriction endonuclease SmaI. The vanA gene was found in 203 isolates (127 E. faecium, 31 E. faecalis, 34 E. durans, 10 E. hirae and one E. gallinarum) exclusively from 50 (43,5%) poultry samples, in no case in isolates from pork samples. We could not detect strains possessing the vanB gene. The vanC1-Gen could be proven in 39 E. gallinarum isolates from 24 (20,7%) poultry samples and a pork sample (2,0%). One E. gallinarum isolate was vanA- and vanC1 gene positive. The vanC2-Gen could be proven in one E. flavescens and 22 E. casseliflavus isolates from 12 (10,4%) poultry samples and four (8,0%) pork samples. The vanC3-Gen could be proven in one E. flavescens and eight E. casseliflavus iso- lates from two (1,7%) poultry samples and three (6,0%) pork samples. One E. flavescens and eight E. casseliflavus isolates was vanC2 and vanC3 gene positive. VanC positive VRE could be detected in 33 poultry (28,7%) and five pork samples (10,0%). Of it we could detect VRE possessing vanA and vanC genes in 14 poultry samples. All enterococci, possessing the vanA gene, were examined with the RAPD and the PFGE method. The RAPD turned out in connection with the DNA isolation with the QIAamp tissue kit in the available work as a reliable and reproducible procedure for the fine classification inter speciem. The biochemical identified species E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. casseliflavus and E. gallinarum could be assigned with the universal primer \u27kay3\u27 in each case a specific banding pattern and therefore likewise identified. The investigations with the PFGE show that the isolates from the humane clinical area is to be defined of those from food clearly. Besides the enterococci is characterized by a considerable genotypic heterogeneity. The results of the PFGE investigations and the similarities of the banding patterns of some Enterococcus isolate could be documented on the basis of dendrograms. It is shown that the largest agreement of the SmaI restriction pattern is between the isolates from poultry and the clinical isolates about 78%. The results permit the conclusion that food of animal origin must be regarded by the application of feeding antibiotics in the animal mast as the further source for the resistance development. Also after the avoparcin prohibition further VRE strains are to be proven