Neural differentiated embryonic stem cells : from cell biology to cell replacement therapy

Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift stellt die Differenzierungskapazität von murinen embryonale Stammzellen in die neurale Richtung und deren Verwendung für embryologische Studien zur Neurogenese dar. Darüber hinaus wird ihre Eignung als Ausgangsmaterial für Zellersatztherapien bei neurodegenerativen Erkrankungen modellhaft charakterisiert. Der erste Abschnitt der Arbeit befasst sich mit der Differenzierungspotenz der Zellen zu Neuronen, unter Verwendung eines FCS- und Retinsäure-haltigem Kultivierungsmediums. Die entstehende Vielfalt von differenzierenden neuronalen Phänotypen wird immunzytochemisch beurteilt und die Neurone zusätzlich anhand ihres Rezeptorprofiles elektrophysiologisch charakterisiert. Die Übertragbarkeit der Befunde auf die in vivo- Situation wird ausführlich diskutiert. Aufgrund der immensen Bedeutung des Kalziumhaushaltes während der neuronalen Differenzierung, wird die Ausstattung der differenzierenden Neurone hinsichtlich spannungsabhängiger Kalziumkanäle sowie Kalzium-bindender Proteine untersucht. Dabei kann eine differenzierungsabhängige Verschiebung des Kalziumkanalmusters beobachtet werden. Dagegen ist die Expression der verschiedenen Kalzium-bindenden Proteine auf bestimmte neuronale Reifungsstadien beschränkt. Die Untersuchung der Differenzierungskapazität in Makro- und Mikrogliazellen ergänzt die Charakterisierung der neuronalen Differenzierung. In einem experimentellen Abschnitt wird die Bedeutung der NO-Synthase II für die neuronale Differenzierung im Vergleich mit der neuronalen kortikalen Primärkultur demonstriert. Die Daten korrelieren mit in vivo Befunden zur Rezeptorgenese der Riechschleimhaut und des Vestibulocochlearorgans sowie mit Befunden der Kortex- und Retinaentwicklung an embryonalen Schnittserien. Parallel dazu kann mit Hilfe einer Knock-out- ES-Zellinie, die eine Defizienz für das ß1-Integrin aufweist, die Notwendigkeit dieses transmembranären Moleküles für eine regelgerecht ablaufende Differenzierung gezeigt werden. Schließlich demonstriert der experimentelle Abschnitt unter Verwendung von pharmakologischen Methoden und mit Hilfe einer Vitalbeobachtung der differenzierenden Neurone den Effekt einer Glutamatintoxikation auf sich entwickelnde Nervenzellen. Somit eignet sich das Modell der embryonalen Stammzellen auch für die Evaluation von neurotoxikologischen Fragestellungen. Im letzten Abschnitt der Arbeit steht die modellhafte Verwendung von neural differenzierten ES-Zellen für Zellersatztherapien im Vordergrund. Dazu werden neural selektionierte ES-Zellen eines Klones mit einer GFP-Expression unter der Kontrolle des ß-Aktinpromoters, zur sicheren Identifizierung der Zellen im Empfängergewebe, in das Striatum adulter Ratten transplantiert und ihre Differenzierungskapazität in Neurone und Gliazellen beurteilt. Unter Verwendung eines weiteren ES-Zellklones, bei dem die GFP-Expression unter der Kontrolle des 2. Introns des humanen Nestingens steht, kann die Selektion der neuralen Vorläuferzellen in vitro unmittelbar verfolgt werden. Damit wird die Voraussetzung für eine nahezu 100%ige Aufreinigung der Zellen mittels präparativen FACS geschaffen. Hinsichtlich einer zukünftigen Therapie des M. Parkinson unter Verwendung von humanen ES-Zellen kann anhand dieser murinen Zellinie, eine Erhöhung des Prozentsatzes dopaminerger Neurone mit Hilfe eines Inhibitors der Phosphatidylinositokinase 3 in Kultur modellhaft dargestellt werden. Tatsächlich wird anhand des Tiermodelles für die humane Makuladegeneration gezeigt, daß neural differenzierte ES-Zellen im Rahmen einer Zellersatztherapie die Verbesserung des krankhaften Zustandes bewirken. Als Lieferanten protektiver neurotropher Faktoren halten sie fortschreitende Degenerationsprozesse auf.The presented thesis deals with the differentiation capacity of murine embryonic stem cells into the neural lineage and their use in embryological studies regarding neurogenesis as well as their use as cell material for cell replacement therapies in neurodegenerative diseases. In the first section of this work the differentiation potency of ES-cells into the neuronal direction in a cultivation medium supplemented with FCS and retinoic acid is elucidated. The variety of differentiating neuronal phenotypes is evaluated immunocytochemically and additionally generated neurons are characterized electrophysiologically regarding their receptor profiles for the main excitatory and inhibitory neurotransmitters. The conveyance of the obtained data to the situation in vivo is thoroughly discussed. In order to meet the extraordinary significance of the calcium homeostasis during neuronal differentiation the occurrence of voltage gated calcium channels as well as calcium binding proteins is investigated. While there is a differentiation-dependent shift in the expression of calcium channels subtypes in all maturation stages, the expression of calcium binding proteins is restricted to certain neuronal subtypes. In addition to the thorough characterisation of neuronal differentiation in the ES-cell system, the differentiation capacity into macro- and microglial cells is evaluated. In the following experimental section the significance of the NO-synthase II for neuronal differentiation is studied in comparison with the primary culture of embryonic cortex neurons. Furthermore, data are correlated with in vivo findings concerning olfactory and vestibulocochlear receptorgenesis as well as with findings from cortical and retinal development. In a second experimental approach using a ß1-integrin knock out ES-cell line, the necessity of this transmebrane molecule is demonstrated for an undisturbed neuronal differentiation by modulating cell-cell and cell-matrix interaction. Additionally, using computer assisted vital microscopy the effect of a glutamate intoxication is evaluated on differentiated neurons, indicating the use of ES-cells as a model system for neuro- and embryo-toxicological studies, respectively. In the final section of this work the use of neurally differentiated embryonic stem cells for cell replacement therapies is evaluated. In order to determine the differentiation capacity of neurally selected stem cells in vivo after transplantation, cells of an ES-cell clone with a GFP-expression under the control of a ß-actin promoter are applied. Thus, transplanted cells can be unequivocally identified after stereotactic injection into the adult striatum and furthermore, their differentiation into neurons and astrocytes can be investigated immunocytochemically. With a second genetically modified ES-cell clone with a GFP expression under the control of the second intron of the human nestin gene, the selection of neural precursor cells can be directly monitored in vitro. This procedure offers a tool to obtain a near pure population of neural precursor cells by preparative flow cytometry (FACS). In order to prepare neural differentiated ES-cells for a specific treatment of Parkinson`s Disease it is demonstrated how the percentage of TH positive dopaminergic neurons can be markedly increased by incubating the cells in the presence of the inhibitor for the phosphatidylinositolkinase 3. Finally, an actual benefit using neurally selected ES-cells is shown in an animal model for the human macula degeneration. In this model neurally selected ES-cells have the potency to delay continuous degeneration processes by supplying neuroptotective factors