Effect of Na+/H+ exchanger-inhibition on infarct size in ischemic, reperfused porcine hearts

Ziel dieser Arbeit war es am Schweinemodell in vivo die kardioprotektive Wirkung der Inhibition der myokardialen Natrium-Protonen-Austauscher (NHE1) mit den neuen pharmakologischen Blockern BIIB513 und BIIB722 sowie den dazugehörigen Wirkungsmechanismus zu untersuchen und mit der ischämischen Präkonditionierung zu vergleichen. Hierzu wurden die NHE1-Inhibitoren sowohl systemisch als auch über feine Nadeln lokal-intramyokardial verabreicht und eine 60 oder 90 minütige Ischämie induziert, indem der Ramus interventricularis paraconalis der linken absteigenden Koronararterie (LAD) reversibel okkludiert wurde. Es folgte jeweils eine 60 minütige Reperfusion. Bei der Kontrollgruppe zeigte sich nach 60 minütiger Ischämie eine Infarktgröße (IS) von 61,1%. Die systemische Verabreichung von BIIB513 reduzierte diese auf 43,1% (1,5mg/kg). Bei systemischer BIIB722-Applikation verringerte sie sich auf 41,4% (1,5mg/kg) und 40,0% (3mg/kg) (p < 0,05). Die NHE1-Blockade zeigte auch bei intramyokardialer Applikation eine lokal-anti-nekrotische Wirksamkeit, indem das Myokard im Infusionsgebiet der Nadeln vor der Infarktentstehung geschützt blieb. Im Vergleich mit der NHE1-Inhibition zeigte die ischämische Präkonditionierung eine etwa gleich starke Infarktgröße-reduzierende Effizienz. Das Präkonditionierungsprotokoll von jeweils zwei Zyklen einer 10 minütigen Ischämie und 10 minütiger Reperfusion reduzierte die Infarktgröße auf 31%. Außerdem wurde gezeigt, daß bei einer Verlängerung der Ischämiedauer auf 90 Minuten die NHE1-Inhibierung keine Infarktgröße-verringernde Wirkung mehr hatte. Im weiteren Verlauf der Studie wurde, im Hinblick auf den Vergleich der beiden Wirkungsmechanismen der NHE1-Inhibierung und der ischämischen Präkonditionierung, die Rolle der ATP-abhängigen Kaliumkanäle (KATP-Kanäle) und der p38-MAPK bei der NHE1-Inhibierung untersucht. Diesbezüglich findet sich in der Literatur, daß innerhalb der Signaltransduktionskette der ischämischen Präkonditionierung eine Aktivierung der KATP-Kanäle und eine Inhibierung der p38-MAPK stattfindet 131,266,274. Hierfür wurde eine simultane Blockade der KATP-Kanäle während der BIIB722 vermittelten NHE1-Inhibition erzeugt. Es wurden jeweils die pharmakologischen KATP-Kanal-Blocker Glibenclamid und 5-Hydroxydecanoat systemisch verabreicht und gleichzeitig BIIB722 intramyokardial infundiert. Der BIIB722-vermittelte lokal-anti-nekrotische Myokardschutz blieb erhalten. Dies spricht dafür, daß eine Aktivierung der KATP-Kanäle innerhalb des Schutzphänomens der NHE1-Blockade nicht stattfindet. Zudem wurde mittels einer Western-Blot-Analyse die phosphorylierte Form der p38-MAPK (P-p38-MAPK) in der zytosolischen Fraktion von Gewebeproben von Tieren bestimmt, welche nach einer Vorbehandlung mit BIIB722, zu den Zeitpunkten eines funf-, zehn- und 15 minutigen LAD-Verschlusses aus dem Ischamiegebiet des linken Ventrikels entnommen wurden. Bei Kontrolltieren ergab sich ein mit zunehmenden Dauer der Ischamie ansteigender P-p38-MAPK-Gehalt, welcher nach zehn minutiger (323,2%) und 15 minutiger Ischamie (489,1%) im Vergleich zu praischamisch entnommenen Kontrollbiopsien des unstimulierten Myokards (100%) signifikant war (p ? 0,05). Die Untersuchung des Phosphorylierungsstatus der p38-MAPK bei Ischamie unter dem Einfluß der NHE1- Inhibierung, ergab hingegen nur eine verhaltene Zunahme zu Beginn der Ischamie und zeigte im Verlauf keinen weiteren Anstieg. Nach zehn Minuten zeigte sich der maximale Gehalt der P-p38-MAPK bei 158,3% (p < 0,05), welcher nach 15 Minuten wieder absank. Die P-p38-MAPK-Bande der mit BIIB722 behandelten Gruppe war somit signifikant geringer im Vergleich zu dem Gehalt der P-p38-MAPK der Kontrollgruppe (p < 0,05). Diese kardioprotektive p38-MAPK-Dephosphorylierung ist somit beiden Schutzphanomenen gemeinsam. Untersuchte man die unphosphorylierte Form der p38-MAPK, so zeigte sich anhand der gleich stark ausgepragten Banden auf einer Hohe von 38 kDa ein gleichbleibender Gehalt der unphosphorylierten p38-MAPK. Die in der Literatur oftmals vertretene Hypothese, dass die ischamische Prakonditionierung und die Na+/H+-Austauscher-Inhibition nicht auf einem gemeinsamen Wirkmechanismus zuruckzufuhren sind, wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung bestatigt: Es wurde gezeigt, dass die pharmakologische NHE1-Inhibition KATP-Kanal-unabhangig ist, wahrend die ischamische Prakonditionierung nachweislich eine KATP-Kanal-Aktivierung bewirkt. Die beiden Phanomene zeigten jedoch auch vergleichbare Effekte: Erstens eine gleich starke Infarktgröße-reduzierende Effizienz bei 60 Minuten, welche zeitlich auf eine Stunde begrenzt und somit transient war und zweitens eine kardioprotektive Deaktivierung der p38-MAPK. Diese Uberschneidungen sprechen fur Gemeinsamkeiten dieser beiden Schutzmechanismen im Schweinemyokard. Interaktionen zwischen beiden Signalketten auf einer oder mehreren Ebenen sind somit denkbar.This study compared the cardioprotective efficacy of ischemic preconditioning (IP) and myocardial sodium-hydrogen-exchanger (NHE1) inhibition and examined the interactions between NHE1-inhibition and IP. In a porcine model of left anterior descending artery (LAD)-occlusion, either IP, produced by two cycles of 10-minute LAD-occlusion and 10-minute of reperfusion, or one of the the new pharmacological inhibitors BIIB513 (1.5 mg/kg) and BIIB722 (1.5 and 3 mg/kg) were administered before a 60-minute LAD-occlusion followed by one hour of reperfusion. BIIB722 was also tested in pigs treated with 90-minute ischemia and one hour of reperfusion. The infarct size (IS) was determined by TTC-staining and expressed as a percentage of the area at risk. Althrough both IP and the NHE1-inhibition produced comparable and significant reductions in IS in the 60-minutes occlusion model, insignificant reduction in IS by BIIB722 was observed in the 90-minute occlusions model. Compared with control animals (IS=61.1%), IP reduced the IS to 31%, BIIB513 (1.5 mg/kg) to 43.1% and BIIB722 (1.5 and 3 mg/kg) to 41.4% and 40.0%. Furthermore BIIB722 was also given via intramyocardial (50µM in NaCl/DMSO) microinfusion-needles into the prospective area at risk before a 60-minute ischemia followed by one hour of reperfusion. A marked myocardial protection was shown by the presence of viable (TTC-stained) myocardium around microinfusion-needles delivering BIIB722 that was not seen around needles with solvent. Since IP was first described numerous factors such as the KATP-channel-activation and the p38-MAPK-pathway have been shown to contribute to its cardioprotective effect. Pharmacologic inhibition of the KATP-channel has been shown to block IP 266,274. Furthermore, p38-MAPK-stimulation, which is known to be the cause for accelerated cell death, is inhibited by IP 131. To investigate whether IP and NHE1- Inhibition convey protection through distinct or similar mechanisms the role of KATP-channel-activation and the p38-MAPK-pathway in NHE1-inhibition were explored. Despite the simultaneous systemic application of either Glibenclamide, a sarcolemmal and mitochondrial KATP-channel-blocker or 5-Hydroxydecanoate (5- HD), a specific mitochondrial KATP-channel-blocker, the local-antinecrotic effect of intramyocardial BIIB722-microinfusion was maintained. Apparently KATP-channelactivation does not occur during NHE1-Inhibition. Next the amount of dual-phosphorylated p38-MAPK (Thr180/Tyr182) was measured by Western blot analysis during index ischemia that followed the systemic infusion of BIIB722 or the solvent. The ventricular drill biopsies were taken from nonischemic (control) and also from the ischemic myocardium at various timepoints of LAD-occlusion. In the solvent-treated group there was a significant increase of phospho-p38-MAPK during ischemia with a maximum reached at 15 minutes of occlusion (489.1%) compared with nonischemic myocardium (100%). The BIIB722 treatment significant reduced the content of phospho-p38-MAPK of myocardium at 10-minute of ischemia (158.3% vs. 323.2% of solvent treated group). Thus, cardioprotective p38-MAPK-dephosphorylation, which also occured during IP, is a common mechanism of NHE1-inhibition and IP induced cardioprotection. The content of nonphosphorylated p38-MAPK remained unchanged in solvent- and BIIB722 treated tissue. The results of these study support the hypothesis that the cardioprotective effects of IP and NHE1-inhibition do not occur via identical pathways. The cardioprotection by pharmacological NHE1-inhibiton appears to be independent of mitochondrial processes, while IP is at least partly mediated by mitochondrial KATP-channelactivation. On the other hand, both IP and NHE1-inhibition provide comparable cardioprotection against 60 minutes of myocardial ischemia and also both result in a deactivation of the detrimental p38-MAPK-pathway. Furthermore, NHE1- inhibition failed to protect the heart against a prolonged ischemic insult (90 minutes), like it has been reported for the IP phenomenon. Thus, while the cardioprotective effects of IP and NHE1-inhibition in the pig myocardium are not mediated by identical pathways, there may still be some overlapping mechanisms or crosstalk between these pathways