Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos Protoonkogens im Hinblick auf Fleischfülle und Merkmalantagonismus beim Schwein

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das porcine c-fos Protoonkogen vor dem Hintergrund seiner ausreichend dokumentierten Rolle als Transkriptionsfaktor bei Zellwachstums- und Zelldifferenzierungsprozessen, vor allem auch im Rahmen von Muskelzellhypertrophie, isoliert und in Form der kompletten Sequenzierung und chromosomalen Lokalisierung charakterisiert. Weiterhin wurde die genetische Variabilität des Genes bei konstitutionell sehr unterschiedlichen Schweinerassen auf Sequenzebene untersucht. Für einzelne manifest gewordene Sequenzpolymorphismen wurden PCR/Restriktionssteme zur Typisierung größeren Tiermaterials entwickelt. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Das c-fos Protoonkogen wurde mittels einer schweinespezifischen Sonde aus einer Lambda-FixII-Genbank vom Schwein isoliert, in Plasmidvektoren subkloniert, und in einer Ausdehnung von insgesamt 4200 bp sequenziert ( EMBL Acc.No.AJ132510 ). Auf der Basis von Homologievergleichen zu anderen Spezies konnte der charakteristische Aufbau des Genes mit den 4 Exon- und 3 Intronbereichen sowie den funktionell wichtigen Domänen und Promotorelementen dokumentiert werden. Das c-fos Gen kodiert für ein 380 Aminosäuren zählendes Protein mit dem charakteristischen bZIP-Motiv als funktionell wichtigster Bereich. Die Homologie zum Menschen beträgt für das gesamte Gen 84,8%, im Bereich der funktionell wichtigen Domäne der basischen Region und des Leucin-Zippers befinden sich keine Basenaustausche. Mit Hilfe eines Schweine-Nager-Zellhybridpanels konnte c-fos auf dem ChromosomSSC 7q12-23 oder q26 lokalisiert werden. Durch Synthenievergleiche mit dem Menschen konnte der wahrscheinliche Lokalisationsort auf SSC 7q23 begrenzt werden. Die Suche nach Sequenzunterschieden zwischen konstitutionell unterschiedlichen Rassen erfolgte mittels spezifisch entwickelter PCR-Systeme zur Amplifikation definierter Sequenzabschnitte mit anschließender Sequenzierung. So konnten für die Rassen Pietrain und Meishan detaillierte Sequenzinformationen über insgesamt 3579 bp des Genes erhalten werden. Insgesamt zeigten sich im Vergleich zur Genbanksequenz zehn Basenaustausche. Davon befinden sich interessanterweise fünf im Bereich des Exon 4, zwei davon gehen mit einem Aminosäurenaustausch auf der Proteinebene einher. An Position 2910 befindet sich beim Meishan im Gegensatz zum Pietrain ein Guanin anstelle eines Adenins, was auf Proteinebene den Austausch eines Asparagins durch ein Serin bedeutet. Dieser Polymorphismus zeigt sich auch zwischen den Spezies, wo Mensch und Hamster die gleiche Sequenz wie das Meishan zeigen. Maus und Ratte sind hier identisch mit Pietrain und der Genbanksequenz. Des weiteren ist an Position 2997 beim Pietrain ein Guanin durch ein Adenin ersetzt wodurch es zum Austausch eines Arginins durch ein Histidin auf Proteinebene kommt. Dieser Austausch wiederholt sich nicht bei anderen untersuchten Spezies. Bei den restlichen handelt es sich um stille Mutationen ohne direkte Auswirkung auf die Proteinzusammensetzung von c-Fos. Alle weiteren Austausche befinden sich im untranslatierten Bereich des Genes, zwei auf Höhe des Intron 1, einer im Intron 3-Bereich und schließlich zwei im Bereich des vorderen 3´Endes. Der mittlere Bereich des Genes von Position 1257 bis Position 2443 mit Teilen des Intron 1 sowie der gesamten Intron 2 und 3 und der Exons 2 und 3 weist keine Unterschiede in der Nukleotidfolge zwischen den untersuchten Tieren auf. Auch das Exon 1 zeigt keine Sequenzunterschiede. Die gefundenen Basen- und Aminosäurenaustausche bedürfen der Verifizierung an größeren Tierzahlen. Zu diesem Zwecke wurden für einzelne Austausche PCR/Retsriktionssysteme entwickelt, die eine Typisierung größeren Probenmaterials ermöglichen. Ein TaqI-Restriktionspolymorphismus entsteht durch den Basenaustausch an Position 2544. Der erste Austausch im Exon 4 an Position 2650 bewirkt einen AluI-Restriktionpolymorphismus. Der mit einem Aminosäurenaustausch einhergehende Polymorphismus an Position 2910 läßt sich durch einen TaiI-Restriktionspolymorphismus nachweisen. Alle hier aufgezeigten RFLP´s müssen anhand von größeren Tierzahlen überprüft werden. Durch das Screenen geeigneten Familienmaterials können dann Assoziations- und Segregationsstudien erfolgen.The objective of the present work was the isolation and characterization of the porcine c-fos protooncogene. The product of this gene plays an important role as a transcription factor in several cell growth and differentiation processes, especially concerning muscle cell hypertrophy. Complete sequencing and chromosomal localization of the gene was realized. Additionally its genetic variability concerning constitutionally very different pig breeds was examined. PCR/Restriction-systems were developed for some of the sequence polymorphisms found, in order to realize further investigations in a large number of animals from different breeds. Following results were obtained: The c-fos protooncogene was isolated from a lambda fixII genomic bank by hybridization to a pig-specific probe, subcloned in plasmid-vectors and sequenced in a range of 4200bp ( EMBL Acc.No.AJ132510 ). The characteristic structure of the gene with its 4 exons and 3 introns and the functionally important domains and promotor elements were documented based on the homology to other species. The c-fos gene represents the code for a protein of 380 amino acids with a characteristic functionally very important bZIP domain. Homology between pig and human is 84,8%, while there are no base exchanges in the functionally very important domains like the basic domain or the leucine zipper. Screening a pig/rodent cell hybrid panel, c-fos was localized on SSC 7q12-23 or q26. By comparing genetic mapping data the localization could be precised to SSC7q23. The search for sequence differences between constitutionally different pig breeds was carried out by developing specific PCR systems for the amplification of defined sequence regions and the following sequencing of these regions. Detailled sequence information over 3579bp was achieved for meishan and pietrain breeds. Ten base exchanges could be documented in comparision to the sequence of the genebank. Five mutations are located in the region of the exon 4, two of them also present an exchange in the protein sequence. First the presence of a guanin in the meishan breed instead of an adenin in pietrains at position 2910 means the exchange of serin to asparagin in the protein. This polymorphism also figures between different species. Human and hamster sequences fit with the meishan while mouse and rat are identical to the pietrain and genebank sequence. There is also an exchange of a guanin to an adenin at position 2997 in pietrains which means the exchange of an arginin to a histidin in the protein. This polymorphism does not appear between other species. All the others are quiet mutations without effect on the protein sequence of c-Fos. The other five base exchanges are located in the untranslated parts of the gene, two in intron 1, one in intron 3 and finally two in the 3´end of the gene. The mid part of the gene from position 1257 to position 2443 including parts of intron 1 as well as the whole intron 2 and 3 and the exons 2 and 3 doesn´t show any sequence differences between the examined animals. The exon 1 is also identical between the two breeds. The base- and amino acid exchanges found must be verified on a larger number of animals. Thats why we established PCR/Restrictionsystems for defined mutations allowing the screening of a large number of probes. A TaqI-RFLP corresponds to the base exchange at position 2544. The first mutation in the fourth exon at position 2910 which corresponds to a TaiI-polymorphism. All described RFLP´s have to be verified on larger animal numbers. The screening of defined families then allows association and segregation studies