Die Quantifizierung von Aminosäurenisomeren in Lebensmitteln mittels chiraler Gaschromatographie-Massenspektrometrie im Hinblick auf die Relevanz und die Entstehungsmechanismen von D-Aminosäuren

1. Ziel und Gegenstand der Untersuchung Es wurden unterschiedliche, durch mikrobielle Fermentation gewonnene, Lebensmittelgruppen qualitativ und quantitativ auf ihren Gehalt an freien D- und L-Aminosäuren (AS) hin untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Überprüfung der erhaltenen AS-Muster in bezug auf ihre Eignung zur Charakterisierung der entsprechenden Nahrungsmittel und in der Evaluierung typischer chemischer Marker-AS, die als Qualitäts- und Authentizitätsindikatoren für bestimmte Produkte zum Einsatz kommen könnten. Durch die Ermittlung der zeit- und pH-Wert-abhängigen Racemisierungskinetiken einer Vielzahl proteinogener AS in Standardlösungen und in Lebensmittelmatrices sollte die besondere Anfälligkeit bzw. die Unempfindlichkeit spezieller AS gegenüber der Racemisierung im schwach sauren pH-Bereich (pH 2,5) aufgeklärt werden. Zusätzlich wurden mögliche Auswirkungen der Maillard-Reaktion auf den Racemisierungsgrad bestimmter AS untersucht. Daneben wurde der Einfluß technologisch bedingter Lebensmittelbehandlung anhand der Mikrowellenerhitzung von Gelatine bzw. Gelatinepartialhydrolysat auf die Bildung der potenziell toxischen AS cis-4-Hydroxy-L-Prolin (cis-4-L-Hyp) überprüft. Dabei galt es, widersprüchliche Ergebnisse vorangegangener Studien kritisch zu hinterfragen. 2. Untersuchungsmethoden Die Aufarbeitung flüssiger Proben (Essig, Bier) erfolgte durch Aufreinigung mittels DOWEX-Kationentauscher. Feste Proben (Getreide, Malz, Hopfen) wurden vermahlen und in 0,1 M HCl suspendiert. Anschließend erfolgte eine Entfettung und Proteinfällung mit nachgeschalteter DOWEX-Behandlung. Gelatine bzw. Gelatinepartialhydrolysat wurden einer sauren Totalhydrolyse unter Standard-bedingungen (6 M HCl, 110 °C, 24h) unterzogen. Die Separation der AS-Isomeren in Form unterschiedlicher Perfluoracyl-AS-Alkylester-Derivate wurde mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie an der chiralen stationären Phase Chirasil-L-Val durchgeführt. Die Quantifizierung erfolgte nach der Methode des internen Standards mit L-Norleucin. 3. Ergebnisse der Untersuchung In allen untersuchten fermentierten Lebensmitteln wurden die für mikrobielle Tätigkeit charakteristischen chemischen Marker D-Alanin (D-Ala), D-Asparaginsäure (D-Asp) und D-Glutaminsäure (D-Glu) in teilweise beträchtlichen Mengen detektiert. Demnach fand bei allen Produkten eine echte biologische Gärung statt. Bei Speiseessigen konnten je nach eingesetzten Rohmaterialien typische AS-Muster ermittelt werden. Bei italienischen Balsamessigen (Aceto Balsamico di Modena) war mit zunehmendem Alter ein signifikanter Anstieg der relativen und absoluten Gehalte an D-Ala und D-Prolin (D-Pro) zu verzeichnen. Insbesondere D-Pro könnte als Altersindikator für solche Produkte dienen, die oft einer langjährigen Reifung unterzogen werden. Auch Sherryessige und gereifte Rotweinessige zeigten hohe relative Gehalte an D-AS, der Absolutgehalt lag jedoch deutlich niedriger als bei Balsamessigen. Durch die Erfassung der Racemisierungskinetiken der mittels der verwendeten GC-MS-Methode bestimmbaren proteinogenen AS konnte eine säurekatalysierte Racemisierung von Pro in schwach sauren Lebensmitteln (pH 2-3) als vernachlässigbar gering eingestuft werden. Das Maximum der Racemisierungsrate von Asp bei pH 2,5 erklärt sich durch die Ausbildung eines planaren, durch eine intramolekulare Wasserstoffbrücke stabilisierten, Übergangszustandes zwischen [beta]-Carboxylgruppe und [alpha]-Carboxylatgruppe in Form eines siebenatomigen Ringes. Für Serin (Ser) ergibt sich ein ähnliches Zwischenprodukt, vermutlich durch Ausbildung eines Sechsringes zwischen dem Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe und dem negativ geladenen Sauerstoffatom der Carboxylatgruppe. Daher ist bei Asp und in geringerem Maße auch bei Ser mit einem gewissen säurekatalysierten Racemisierungsanteil bei schwach sauren bzw. sauer fermentierten Lebensmitteln zu rechnen. Für Pro konnte eine sehr hohe Racemisierungsrate im Verlauf der beim Erhitzen mit einem Glucose/Fructose-Gemisch zunehmend intensiver werdenden Maillard-Reaktion ermittelt werden. Diese ist vermutlich für die zeitabhängige Zunahme des Gehaltes der Indikator-AS D-Pro in Balsamessigen verantwortlich. Die Untersuchung der Biere und Bierrohstoffe ergab, daß der Beitrag der Rohstoffe zu den in Bieren detektierten D-AS vernachlässigbar (Hopfen) bis gering ist (Gerste, Malz). Der Hauptanteil der in den Bieren nachgewiesenen D-AS wurde auf die Aktivität der Racemasen der am Brauprozeß beteiligten Mikroorganismen zurückgeführt. Während gewöhnliche ober- und untergärige Biere wie Alt, Weizen, Pilsener oder Export nur geringe Mengen der typischen Marker D-Ala, D-Asp und D-Glu sowie Spuren von D-Pro enthielten, konnten in Spezialbieren, die unter Verwendung von Milchsäurebakterien (Berliner Weisse) oder Milchsäurebakterien und Wildhefen durch Spontangärung (belgische Lambic-Biere) hergestellt wurden, qualitativ und quantitativ deutlich mehr D-AS detektiert werden. Biere des Typs Berliner Weisse, bei denen die Flaschengärung unter Addition von Lactobacillus delbrueckii ablief, wiesen mehr als 20% D-Pro auf. Dies ist vermutlich auf eine bakterielle Pro-Racemase zurückzuführen. Demnach eignet sich die enantioselektive AS-Analyse insbesondere zur Charakterisierung von Spezialbieren besonderer Produktionsweisen. Die Erhitzung von Gelatine bzw. Gelatinepartialhydrolysat mittels eines haushaltsüblichen Mikrowellengeräts ergab, daß dabei nicht, wie in der Literatur postuliert, antifibrotisch und damit potenziell toxisch wirkendes cis-4-L-Hyp gebildet wird. Die selbst in nicht erhitzten Kontrollen detektierten Mengen von ca. 5% cis-4-D-Hyp stellen ein Artefakt dar, welches aus der zur Analyse notwendigen sauren Totalhydrolyse der Proben resultiert. Somit kann die in der Literatur postulierte mögliche Gefährdung des Verbrauchers durch die mikrowelleninduzierten Bildung von toxischem cis-4-L-Hyp in gelatinehaltigen Lebensmitteln ausgeschlossen werden.Quantification of amino acid isomers in food using chiral gas chromatography - mass spectrometry with regard to relevance and mechanisms of the formation of D-amino acids 1. Subject and aim of the investigation Different groups of microbial fermented foodstuffs were investigated qualitatively and quantitatively for their amounts of free D- and L-amino acids (AA). Patterns of AA-isomers were determined with regard to the possibility of food characterization by the evaluation of typical chemical marker-AAs, that could serve as indicators for quality and authenticity control of fermented foods. Further, time and temperature dependent kinetics of AA-racemization were determined in solutions of a standard AA-mixture in aqueous acetic acid (pH 2,5) and in a microbial fermented wine vinegar. The deviating sensitivities of certain AAs towards racemization at moderate pH values in comparison to their respective racemization rates in strong mineral acids should be elucidated Additionally, the influence of the Maillard reaction on the rate of racemization of certain AAs was determined. The influence of microwave heating of gelatin, and a partial hydrolysate of gelatin, on the formation of the antifibrotic and therefore potentially toxic AA cis-4-Hydroxy-L-proline (cis-4-L-Hyp) was investigated in order to prove a report on the generation of cis-4-L-Hyp due to microwave heating of gelatin from its epimer trans-4-L-Hyp which is a natural component of gelatin. 2. Methods Liquid samples (vinegar, beer) were treated with DOWEX-cation exchanger to isolate the AAs. Solid samples (grains, malts, hops) were milled and suspended in 0,1 M HCl followed by de-fatting and protein precipitation. Then, the supernatants were subjected to the cation-exchanger. Gelatin and partial hydrolysates of gelatin were totally hydrolyzed under standard conditions (6 M HCl, 110 °C, 24 h) to release the AAs from the respective proteins and peptides. Gas chromatographic separation of AA-isomers was carried out using different perfluoroacyl AA alkylester-derivatives on the chiral stationary phase Chirasil-L-Val. For highly sensitive and specific detection a mass spectrometer was chosen. Quantification was performed via the internal standard L-norleucine. 3. Results and conclusions The chemical markers D-alanine (D-Ala), D-aspartic acid (D-Asp) and D-glutamic acid (D-Glu) characteristic for microbial fermentation were detected in all samples of fermented foods. Depending on the raw materials used for vinegar production characteristic patterns of AAs were determined. Italian balsamic vinegars (Aceto Balsamico di Modena) showed a significant increase of the absolute and relative amounts of D-Ala and D-proline (D-Pro) during maturation. Especially D-Pro might serve as an indicative for prolonged ripening and ageing. In sherry vinegars and matured red wine vinegars high relative amounts of D-AAs were detected. The absolute amounts, however, were much lower than in balsamic vinegars. Results of the time and pH-dependent racemization kinetics of proteinogenic AAs, determinable with the GC-MS-method used, showed that Pro does racemize to a negligible extent at moderate acidic pH (pH 2-3). Therefore, an acid catalyzed mechanism for the racemization of Pro in balsamic vinegars could be excluded. The maximum rate of racemization of Asp at pH 2,5 was explained by the formation of a planar intermediate which is stabilized by an intramolecular hydrogen bond between [beta] bond between [beta-carboxyl group and [alpha]-carboxylate group resulting in a seven membered ring system. For Ser a similar intermediate was postulated via formation of a six membered cycle between the hydrogen atom of the hydroxyl group and the negative charged oxygen atom of the carboxylate group. Therefore, acid catalyzed racemization of Asp and, to a lower extent, Ser might contribute to the amounts of D-AAs detected in acidic fermented foods. Heating of a mixture of glucose and fructose together with L-Pro led to a very high rate of Pro-racemization in the course of the so-called Maillard-Reaction. This might explain the time-dependent increase of the ageing indicator D-Pro in balsamic vinegars during maturation. The quantification of AA-enantiomers in beers and raw materials used for manufacturing revealed that raw materials contribute to a negligible (hops) or minor (grains, malts) extent to the D-AA content of beer. Therefore, the amounts of D-AAs detected in beers were mainly attributed to the activity of the racemases of the microorganisms used for brewing. Common top- and bottom-fermented beers like \u27Altbier\u27, wheat beer, Pilsener or lager contained the typical marker-AAs D-Ala, D-Asp and D-Glu in low amounts, as well as D-Pro in traces. However, in special beers produced by the addition of Saccharomyces-yeast and lactic cultures (\u27Berliner Weisse\u27) or by spontaneous fermentation using wild yeasts together with lactic cultures (Belgian lambic beers) significantly higher relative and absolute amounts of D-AAs were detected. \u27Berliner Weisse\u27 beers that underwent bottle conditioning (secondary fermentation) with Lactobacillus delbrueckii contained more than 20% D-Pro. From the data it is concluded that the enantioselective AA-analysis is in particular suitable for the characterization of special beers that are subjected to extraordinary fermentation conditions. Heating of gelatin and an enzymatic partial hydrolysate of gelatin in a common microwave oven did not, as assumed in the literature, lead to the formation of the antifibrotic and therefore potentially hazardous AA cis-4-L-Hyp. Amounts of ca. 5% cis-4-D-Hyp detected even in untreated controls were shown to be an artifact, resulting from the acidic total hydrolysis of the samples. Therefore, a possible health risk for consumers due to the microwave-induced formation of potentially toxic cis-4-L-Hyp in foodstuffs containing gelatin or partial hydrolysates of gelatin can be excluded