Resveratrol as an example for the molecular mechanisms of the antiproliferative effect of plant polyphenols

Das pflanzliche Polyphenol Resveratrol, kommt unter anderem in Rotwein, Weintrauben und Erdnüssen vor und wirkt chemopräventiv. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Wachstumshemmung durch Resveratrol auf kolorektale Karzinomzellen zu charakterisieren. Zellkultur: HCT-116 und Caco-2 (kolorektale Karzinomzelllinien) Zytotoxizität: Laktatdehydrogenasemessung im Überstand Zellzahl: Kristallviolettfärbung Proliferation: [3H]-Thymidin- bzw. [14C]-Leucineinbau Caspase-3 Aktivität: fluorometrischer Enzymassay Alkalische Phosphataseaktivität: kolorimetrischer Enzymassay Proteine: Western blot transformierender Wachstumsfaktors-beta1 (TGF-beta1): ELISA im Überstand Ornithindecarboxylase (ODC)- und S-Adenosylmethionindecarboxylase (SAMDC)-Aktivität: [14CO2]-Freisetzung aus [14C]-Ornithin bzw. [14C]-S-Adenosylmethionin mRNA: Polymerasekettenreaktion Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase (SSAT)-Aktivität: [3H]-Acetyl-CoA-Transfer auf Spermidin Intrazelluläre Polyaminkonzentration: HPLC DNA-Bindungsaktivität von c-Fos und c-Jun: ELISA-basiertes Verfahren Eine resveratrolinduzierte Wachstumshemmung der Zelllinien Caco-2 und HCT-116 (12,5-200 µM) wurde durch konzentrationsabhängige Hemmung der Proliferation verursacht. Resveratrol verschob die Zellzyklusdistribution zugunsten der S-Phase-Population (am deutlichsten bei 50 µM) parallel zur Reduktion zellzyklusregulierender Proteine (Cyclin D1, cyclinabhängige Kinase (Cdk)4 und p27Kip1). Die Expression der Cycline A und E nahm zu. Der Retinoblastomaproteinspiegel wurde reduziert und bei 200 µM konnte eine Hypophosphorylierung und damit Aktivierung des Proteins detektiert werden. Diese Wirkungen waren spezifisch für Resveratrol, da die Strukturanaloga Rhapontin und Stilbenmethanol keine Alteration der Zellzyklusverteilung bewirkten. Apoptose erfolgte ebenfalls nach Behandlung von Caco-2 Zellen mit Resveratrol (200 µM). Auch das Resveratrolanalogon Piceatannol wirkte wachstumshemmend auf Caco-2 und HCT-116 Zellen. Die Proliferation von Caco-2 Zellen wurde gehemmt, es konnte jedoch keine differenzierungsfördernde Wirkung verzeichnet werden. Eine Zellzyklushemmung in der S-Phase fand neben einer konzentrationsabhängigen Abnahme der Proteine Cyclin D1, Cyclin B1, Cdk4 und p27Kip1 statt. Die Proteinmenge von Cdk2, Cdk6, Cdc2 und p21Waf1/Cip1 wurde nicht beeinflusst, wohingegen koinzident die Cycline E und A vermehrt exprimiert wurden. Die gleichen Veränderungen der zellzyklusregulierenden Proteine nach Piceatannolbehandlung konnten bei HCT-116 Zellen beobachtet werden. Im Vergleich war die wachstumshemmende und antiproliferative Wirkung Resveratrols (50 µM) ausgeprägter als die der kurzkettigen Fettsäure Butyrats (2 mM) und ließ sich auch bei gleichzeitiger Gabe beider Substanzen nicht verstärken. Während Resveratrol alleine nicht differenzierungsfördernd wirkte, potenzierte es die butyratinduzierte Differenzierung (Erhöhung der alkalischen Phosphatase-Aktvität und der E-Cadherin-Expression). Die butyratvermittelte p21Waf1/Cip1-Expression wurde erhöht, während p27Kip1 und TGF-beta1 an diesem Differenzierungsvorgang nicht beteiligt zu sein schien. Auf die Polyaminsynthese in Caco-2 Zellen wirkte Resveratrol inhibitorisch, indem es, ebenso wie Piceatannol die SAMDC- und die ODC-Aktivität hemmte. Beide Stilbene wirkten über Reduktion des ODC-Proteins, jedoch war nur durch Resveratrol eine deutliche odc-mRNA-Abnahme zu verzeichnen. Eine Abnahme des c-Myc-Transkriptionsfaktors, der das odc-Gen positiv reguliert, wurde durch Resveratrol und Piceatannol bewirkt. Die am Polyaminabbau beteiligte SSAT wurde durch Resveratrol, jedoch nicht durch Piceatannol stimuliert. Intrazellulär kam es durch Resveratrol zu einem Anstieg von Putreszin und N8-Acetylspermidin, zweier Marker des Polyaminkatabolismus. Resveratrol führte zu einer Zunahme des c-Fos- und des c-Jun-Proteins. Beide Stilbene induzierten die DNA-Bindungsaktivität von c-Fos, jedoch nicht die von c-Jun. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Resveratrol eine Reihe zellulärer Prozesse in Kolonkarzinomzellen beeinflusst, die schließlich in einer Proliferationshemmung sowie Apoptose der Zellen resultieren. In Kombination mit Butyrat wirkt das Polyphenol dagegen differenzierungsfördernd. Auch das Resveratrolanalogon Piceatannol hemmt die Proliferation. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass Resveratrol von pharmakologischem Interesse hinsichtlich der Chemoprävention des Kolonkarzinoms sein könnte.The plant polyphenol resveratrol is an ingredient of red wine, grapes, and peanuts and possesses chemopreventive properties. The aim of the present study was to characterize the molecular mechanisms of growth inhibition exerted by resveratrol on colorectal carcinoma cells. Cell culture: HCT-116 und Caco-2 (colorectal carcinoma cell lines) Cytotoxicity: lactate dehydrogenase determination in the supernatant Cell counts: crystal violet assay Proliferation: [3H]-thymidine and [14C]-leucine incorporation Caspase-3 activity: fluorimetric enzyme assay Alkaline phosphatase activity: colorimetric enzyme assay Proteins: Western blot Transforming growth factor beta1 (TGF-beta1): ELISA in the supernatant Ornithine decarboxylase (ODC) and S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC)-activity: [14CO2]-release from [14C]-ornithine or [14C]-S-adenosylmethionine mRNA: polymerase chain reaction Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase (SSAT)-activity: [3H]-acetyl-CoA transfer to spermidine Intracellular polyamine concentration: HPLC DNA binding activity of c-Fos and c-Jun: ELISA-based assay A resveratrol-induced growth inhibition of Caco-2 and HCT-116 cell lines (12.5-200 µM) was caused by a concentration-dependent reduction of proliferation. Resveratrol caused a cell cycle arrest in the S phase, which was accompanied by a dose-dependent reduction of cell cycle associated proteins (Cyclin D1, Cyclin dependent kinase (Cdk)4 and p27Kip1). The expression of Cyclins A and E was augmented. The intracellular retinoblastoma protein level was reduced in a concentration-dependent manner and with 200 µM a hyperphosphorylation and thus activation of the protein could be detected. The S phase arrest of Caco-2 cells was most prominent after incubation with 50 µM resveratrol. At higher concentrations this effect was less pronounced. These effects were specific for resveratrol, because the structural analogs rhapontine and stilbenemethanol did not influence cell cycle distribution. Apoptosis occured following treatment of Caco-2 cells with resveratrol (200 µM). The natural resveratrol analog piceatannol also exerted growth inhibitory effects on Caco-2 and HCT-116 cells. The proliferation of Caco-2 cells was inhibited, but no promotion of differentiation could be monitored. A cell cycle arrest in the S phase was paralleled by a concentration-dependent reduction of the proteins Cyclin D1 and B1, Cdk4, and p27Kip1. The protein level of Cdk2, Cdk6, Cdc2 and p21Waf1/Cip1 was not influenced, whereas Cyclins E and A were expressed at a higher level. The same alterations of cell cycle related proteins were detected after treatment of HCT-116 cells with piceatannol. Compared with the short chain fatty acid butyrate (2 mM) the growth inhibiting and antiproliferative effect of resveratrol (50 µM) was more powerful and could not be intensified by combination of the two substances. Whereas resveratrol alone did not influence differentiation, it potentiated the butyrate-induced differentiation (augmentation of alkaline phosphatase activity and E-cadherin expression). The butyrate-induced p21Waf1/Cip1 expression was enhanced by resveratrol, whereas the cell cycle inhibitor p27Kip1 and the cytokine TGF-beta1 seemed not to play a role in this context. Resveratrol and piceatannol hampered synthesis of polyamines in Caco-2 cells by inhibition of ODC. Both stilbenes led to attenuated ODC protein levels, but only resveratrol markedly reduced odc-mRNA. An attenuation of the transcription factor c-Myc, which is a positive regulator of the odc gene, was detected after treatment with resveratrol or piceatannol. Both stilbenes inhibited SAMDC activity. The polyamine-degrading enzyme SSAT was stimulated by resveratrol, but not by piceatannol. After incubation with resveratrol an increase of putrescine and N8-acetylspermidine was measured, which are markers of enhanced polyamine catabolism. Resveratrol led to an increase of c Fos und c-Jun proteins. Both stilbenes induced the DNA binding activity of c-Fos, but not of c-Jun. These results demonstrate that resveratrol influences cellular processes in colon carcinoma cells which lead to hampered proliferation and induction of apoptosis. In combination with butyrate the polyphenol promotes differentiation. The resveratrol analog piceatannol also inhibits proliferation. The current data lead us to speculate that resveratrol might be of pharmacological interest towards chemoprevention of colon carcinoma