Isolierung und Strukturaufklärung peptidischer und niedermolekularer bioaktiver Naturstoffe mittels LC/ESI-MS und GC/MS

Im Rahmen der vorliegenden Habilitationsschrift, die auf 13 Original- und Übersichtsarbeiten beruht, werden Beiträge zur Isolierung und Strukturaufklärung peptidischer und niedermolekularer bioaktiver Naturstoffe mittels LC/ESI-MS und GC/MS kumulativ vorgestellt: Der erste Teil dieser Arbeit ist der Isolierung und Sequenzierung neuer und bereits bekannter Peptaibiotika – nicht-ribosomal biosynthetisierter, alpha,alpha-dialkylaminosäurehaltiger Peptidantibiotika aus Pilzen – gewidmet. Im Mittelpunkt standen hierbei die Suche nach neuen peptidischen Wirkstoffen für einen potentiellen Einsatz in der Medizin bzw. im biologischen Pflanzenschutz sowie die Bedeutung der gefundenen Sekundärmetaboliten für die moderne Pilztaxonomie. Unter Verwendung moderner massenspektrometrischer Verfahren wie der HPLC-gekoppelten ESI-Quadrupol/TOF-Hybrid-MS mit Pulsarfunktion (ESI-QqTOF-MS), der Kopplung der nicht-wäßrigen Kapillarelektrophorese (NACE) mit ESI-MS und der HPLC-gekoppelten ESI-Ionenfallen-MS (ion trap, IT) sowie einer peptaibiomischen Vorgehensweise als neuartigem methodisch-analytischem Ansatz wurden aus Pilzen der Gattung Trichoderma/Hypocrea etwa 100 größtenteils neue Sequenzen linearer Peptaibiotika ermittelt. Diese fielen entweder durch ihre neuroleptische Aktivität oder ihre antifungale Wirkung auf die Erreger latenter Rebholzkranheiten der Weinrebe auf. Erstmalig wurde über den Nachweis von N-terminalem Pyroglutamat und C-terminalem L-Alaninol als neue Strukturelemente von Peptaibiotika berichtet. Die Kombination von phylogenetischmolekulartaxonomischer Methoden mit modernen massenspektrometrischen Verfahren führte zur Beschreibung des Brevicompactum-Cladus als neuem Zweig mit vier neuen Arten (Trichoderma arundinaceum, T. protrudens, T. turrialbense und Hypocrea/Trichoderma rodmanii) im Stammbaum der Gattung Trichoderma/Hypocrea. Außerdem wird auf neue bzw. ungewöhnliche Produzenten, Strukturelemente und Baupläne von Peptaibiotika, so z. B. die neue Unterfamilie der Cyclopeptaibiotika, eingegangen, die Geschichte und Perspektiven der Peptaibiotikaforschung werden beleuchtet sowie das Vorkommen von alpha,alpha- Dialkylaminosäuren in der belebten und unbelebten Natur thematisiert. Schließlich wurden die Trifluoracetolyse und die sich anschließende Analyse der Spaltprodukte mittels ESI-MS als geeignetes Verfahren zur Sequenzierung und Strukturaufklärung von Modellpeptiden und Peptaibiotika untersucht und ein repetitiver Spaltmechanismus für homo-Aib-haltige Peptide und Peptaibiotika postuliert. Der zweite Teil der Arbeit stellt die Kopplung von HPLC und hochauflösender ESIMassenspektrometrie als eine unentbehrliche Komplementärtechnologie für die GC/MS beim so genannten „Metabolic Profiling“ am Beispiel von Arabidopsis thaliana als pflanzlichen Modellorganismus dar. Der dritte Teil der Arbeit beleuchtet die Perspektiven der Peptaibiotikaforschung im nächsten Jahrzehnt sowie die Massenspektrometrie als analytische Hochleistungsmethode in den Lebenswissenschaften. Zusammenfassend ist die Massenspektrometrie als derzeit vielseitigster und leistungsfähigster Zweig der Bioanalytik einzuschätzen, deren interdisziplinäre Rolle und Bedeutung für die Lebenswissenschaften in den kommenden Jahren noch weiter wachsen wird.This cumulative habilitation thesis, which is divided into three chapters, comprises of 13 original research and review articles on the isolation and structural elucidation of bioactive peptidic and low-molecular weight natural products by LC/ESI-MS and GC/MS: The first part of this work is devoted to the isolation and sequencing of new and recurrent peptaibiotics, i. e. fungal peptide antibiotics of non-ribosomal origin containing alpha- dialkyl alpha-amino acids. It is focussed on the search for novel peptidic components for potential use in medicine or as biocontrol agents (BCA) in agriculture. A second important aspect is the significance to modern fungal taxonomy of the secondary metabolites discovered. Using state-of-the-art mass spectrometric tools such as HPLC coupled to a pulsar ESI-QqTOF-MS, nonaqueous capillary electrophoresis coupled to ESI-MS, HPLC coupled to ESI-ion-trap-MS, as well as the recently established method of peptaibiomics, more than 100 novel and recurrent linear peptaibiotics produced by strains and species of the genus Trichoderma/Hypocrea were sequenced. Notably, some of them displayed neuroleptic activity, whereas others were highly effective against fungal diseases of grapevine trunks. Furthermore, N-terminal pyroglutamate and C-terminal L-Alaninol are reported as novel constituents of peptaibiotics for the first time. The combination of morphological analyses, molecular phylogenetics and state-of-the-art mass spectrometric tools culminated in the recognition of the Brevicompactum clade as a separate, novel lineage, including T. brevicompactum s. s. as well as four new species, T. arundinaceum, T. protrudens, T. turrialbense, and H./T. rodmanii. New and uncommon fungal producers, structural elements, and building schemes of peptaibiotics as well as the history of research in this field are reviewed, and a new subfamily of peptaibiotics, the so-called cyclopeptaibiotics, is introduced. Future prospects for peptaibiotic research are discussed, and the distribution of biotic and abiotic alpha-dialkyl alpha;-amino acids is critically scrutinised. Finally, trifluoroacetolysis of peptaibiotics as well as peptides and subsequent analysis of its cleavage products by ESIMS are presented as an effective tool for sequencing and structural elucidation of model peptides and peptaibiotics, and a repetitive cleavage mechanism for Aib-containing peptides is postulated. The second part of this work introduces the benefits of HPLC coupled to electrospray ionisation quadrupole time-of-flight mass spectrometry as an indispensable, complementary technique to GC/MS for profiling of secondary metabolites of Arabidopsis thaliana as a plant model organism. The third part of this work discusses the future prospects for peptaibiotic research in the next decade and the role of mass spectrometry as an anaqlytical key technology in life sciences. In conclusion, mass spectrometry can be characterised as the most versatile and powerful discipline in bioanalytics whose interdisciplinary role and importance in life sciences is predicted to grow further in the forthcoming years