Origins of epigenetic changes in tumorous neuroendocrine cells

In der vorliegenden Arbeit wurden die epigenetischen Veränderungen der Tumorsuppressorgene RASSF1A, CDKN2A und PTEN und die virale Präsenz der Polyomaviren MCPyV und SV40 in den neuroendokrinen Tumorentitäten des malignen Melanoms, des kleinzelligen Lungenkarzinoms und des Merkelzellkarzinoms untersucht. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen endo- (&#916;DNMT3b4 und IL-6) und exogener (UV-B Licht, virale Infektion) Faktoren auf Melanom-Zellen, normale humane Melanocyten und Keratinocyten auf den Methylierungsstatus ermittelt. Der Merkelzellpolyomavirus wurde in 92% (p < 0,001) aller Merkelzellkarzinome detektiert. Im kleinzelligen Lungenkarzinom und malignem Melanom konnte der Virus zu je 40% (SCLC: p = 0,01; MM: p = 0,001) der Tumore gefunden werden. Der SV40 Virus konnte in keiner Probe diagnostiziert werden. Die Promotormethylierung von RASSF1A betrug im malignen Melanom 12% (p = 0,033). Im Merkelzellkarzinom war sie hoch (51%; p < 0,001) und im kleinzelligen Lungenkarzinom sehr hoch (94%; p < 0,001). Die Promotormethylierung von CDKN2A war im Vergleich zum Vergleichskontroll-Gewebe im kleinzelligen Lungenkarzinom signifikant erhöht (56%; p = 0,006). Das Tumorsuppressorgen PTEN wies im malignen Melanom eine hohe Promotormethylierung (60%; p < 0,001) auf. Insgesamt wurde keine Korrelation zwischen der viralen Präsenz und einer Hypermethylierung gefunden. Im maligen Melanom wurde PTEN als signifikanter unabhängiger Prognosefaktor für die Überlebenswahrscheinlichkeit identifiziert. Darüber hinaus wurde im malignen Melanom eine Korrelation zwischen der Hypermethylierung von PTEN und einer starken basophilen Degeneration (p = 0,011) sowie mit einer sonnenexponierten Lokalisierung der Tumore (p = 0,043) gefunden. Die Sterblichkeit von Patienten mit einem methylierten PTEN Promotor ist um 75% erhöht (p = 0,014). Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass im malignen Melanom eine Methylierung des PTEN Promotors durch UV Strahlung herbeigeführt werden kann. Diese These wurde durch eine Bestrahlung von Keratinocyten mit UV-B Licht in vitro überprüft. Durch diese UV-B Licht Exposition konnte ein Anstieg der Expression der Methyltransferase DNMT1 und von IL-6 sowie eine vorübergehende Verringerung der Expression der Methyltransferasen DNMT3a und DNMT3b detektiert werden, jedoch konnte keine Promotormethylierung von RASSF1 und PTEN induziert werden. Da bekannt ist, dass IL-6 in der Lage ist die Expression der Methyltransferasen zu regulieren, wurden normale humane Melanocyten und Melanom-Zellen exogen mit IL-6 supplementiert. Durch diese Supplementierung wurde keine Promotormethylierung ausgelöst. Diese Resultate deuten an, dass UV Licht in vivo eine über IL-6 induzierte Promotormethylierung auslöst und damit einen Einfluss auf die Karzinogenese von Hautkrebsentitäten hat.In the present work, the epigenetic changes of the tumor suppressor genes RASSF1A, CDKN2A and PTEN and the viral presence of polyomaviruses MCPyV and SV40 in neuroendocrine tumor entities of the malignant melanoma, small cell lung cancer and merkel cell carcinoma have been investigated. Furthermore the impact of endogenous (&#916;DNMT3b4 and IL-6) and exogenous (UV-B radiation, viral infection) factors on melanoma cells, normal human melanocytes and keratinocytes and according methylation status was determined. The merkel cell polyomavirus was detected in 92% (p < 0,001) of all merkel cell carcinoma. In small cell lung cancer and malignant melanoma the virus was found in 40% (SCLC: p = 0,01; MM: p = 0,001) of tumors. The SV40 virus was not detected in any sample. The promoter methylation of RASSF1A was 12% (p = 0,033) in malignant melanoma. In merkel cell carcinoma the methylation status was high (51%; p < 0,001) and in small cell lung cancer very high (94%; p < 0,001). The promoter methylation of CDKN2A was significantly higher (56%; p = 0,006) in small cell lung cancer than in the control tissue. The tumor suppressor gene PTEN showed a high promoter methylation (60%; p < 0,001) in malignant melanoma. In total no correlation between the viral presence and a hypermethylation was found. In malignant melanoma PTEN was identified as a significant independent factor for prognosis of patient survival. In addition, a correlation between hypermethylation of PTEN and a strong basophile degeneration (p = 0,011) or “sun exposed” localization (p = 0,043) of tumors was shown. Patients mortality with a methylated PTEN promoter is increased by 75% (p = 0,014). These results led to the hypothesis, that in malignant melanoma a methylation of the PTEN promoter could be caused by UV radiation. This assumption was verified by radiation of keratinocytes with UV-B in vitro. After exposition to UV-B radiation expression of methyltransferase DNMT1 and IL-6 was increased, as well as a transient decrease in the expression of the methyltransferases DNMT3a und DNMT3b was detected. However no promoter methylation of RASSF1 and PTEN was induced. It is known, that IL-6 shows the ability to regulate the expression of methyltransferases, therefore normal human melanocytes and melanoma cells were supplemented exogenously with IL-6. By this supplementation no promoter methylation was induced. These results indicate, that UV light in vivo causes a IL-6 induced promoter methylation and therefore influences the carcinogenesis of skin cancer