FoxO1a and SIRT1 in vasculo-proliferative diseases : Major roles in regulating smooth muscle cell proliferation, migration and survival

Vasculo-proliferative disorders such as atherosclerosis, postangioplasty restenosis, and pulmonary hypertension are complex processes that are especially related to vascular smooth muscle cells (VSMCs)45, 78. In the arterial media, VSMC are normally quiescent, however, for the development and progression of the above mentioned diseases it is prerequisite that quiescent VSMCs start to proliferate, migrate and undergo apoptosis. Different extracellular stimuli are responsible for regulating VSMC homeostasis, including growth factors, cytokines and mechanic stress. Through activating the intracellular phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Aktpathway these factors critically regulate the transcriptional activity of the forkhead box O (FoxO) transcription factors via phosphorylation. FoxOs have crucial roles in different biological processes such as proliferation, differentiation, metabolism, aging, cell survival and stress resistance. Intervening VSMC function by affecting FoxO1a function may represent an attractive approach for future therapeutic strategies in the prevention of vasculo-proliferative diseases. Part 1: Upon Akt-mediated phosphorylation under mitogenic conditions, FoxOs depart from the nucleus. However, stabilization and localization of the ranscription factors in the nucleus is a prerequisite for executing their regulatory function. Psammaplysene A, a natural product from the marine sponge Psammaplysilla sp., was revealed to promote retention of FoxO1a in the nucleus of VSMCs by directly regulating FoxO1a localization. The marine compound was demonstrated to affect cell viability and to inhibit VSMC proliferation in vitro and in vivo by inhibiting S-phase due to attenuating cyclin D1 expression. A Psammaplysene A-analogue named F10 similarly affected VSMC behavior. By applying Psammaplysene A and F10 simultaneously, single doses of each compound could be reduced. Dysfunction of pulmonary VSMCs (PASMCs) contributes to the development of pulmonary hypertension. In Part 2 of this thesis I identified FoxO1a to simultaneously modulate proliferation, migration and cell death of PASMCs. Following transduction with constitutive active FoxO1a, proliferation and migration were significantly attenuated, whereas the number of apoptotic cells increased. Caveolin-1 was suggested to mainly mediate this pro-apoptotic response, since only protein expression of caveolin-1 - but not that of any other FoxO1a target involved in apoptosis - was elevated. The effect of FoxO1a on pathologically modified PASMCs was comparable to that on normal cells. This demonstrates FoxO transcription factors to be important in the disease state as well. In Part 3, I showed that SIRT1, a class III histone deacetylase known for controlling longevity in organisms ranging from bacteria to complex eukaryotes, was able to regulate vascular homeostasis and remodeling processes in vitro and in vivo. It did so by deacetylating FoxO factors, thereby inducing their transcriptional activity. Under native conditions, SIRT1 physiologically interacts with FoxO1a. Pharmacological inhibition of SIRT1, as well as knockdown of SIRT1 reduced FoxO1a´s DNA-binding and transactivation capacity leading to attenuated FoxO1a target gene expression. In contrast, the SIRT1 activator resveratrol enhanced FoxO1a´s transcriptional activity. Upon stress conditions, the observed SIRT1/FoxO1a interaction was increased and led to expression of target genes involved in regulating the cells oxidative stress response (e.g. GADD45), thus, shifting FoxO1a´s transcriptional activity towards cell survival. Application of resveratrol protected from apoptotic cell death, whereas inhibition of SIRT1 activity by pharmacologic drugs or siRNA enhanced the apoptotic response. Moreover, embryonic fibroblasts derived from SIRT1 knockout mice were more resistant to oxidative stress-induced apoptosis as compared to wildtype cells.Vaskulo-proliferative Erkrankungen wie Atherosklerose, Restenose nach Koronarintervention sowie pulmonale Hypertonie sind komplexe Erkrankungen der Gefäßwand, bei denen vor allem glatte Gefäßmuskelzellen eine wichtige Rolle spielen. In der Regel befinden sich in der arteriellen Gefäßwand ruhende Gefäßmuskelzellen, unter pathologischen Bedingungen hingegen fangen diese Zellen an zu proliferieren, aus der Media auszuwandern und sogar apoptotisch zu werden. Verschiedenste extrazelluläre Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und mechanischen Dehnungsreize, regulieren die Homöostase der glatten Gefäßmuskelzellen. Über diverse Transmembranrezeptoren aktivieren die genannten Faktoren die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Akt Signaltransduktionskaskade, an deren Ende die Phosphorylierung und Deaktivierung von FoxO-Transkriptionsfaktoren steht. FoxOTranskriptionsfaktoren wiederum spielen eine wichtige Rolle in den unterschiedlichsten biologischen Prozessen, wie Zellproliferation, Metabolismus-Kontrolle, zellulärem Überleben und Stresstoleranz. Eine Wiederherstellung der normalen Gefäßmuskelzell-Funktion durch Regulierung der FoxO-Aktivität könnte eine vielversprechende Strategie zur gezielten Therapie vaskulo-proliferativer Erkrankungen bilden. Teil 1: Die Akt-vermittelte Phosphorylierung der FoxO-Transkriptionsfaktoren sorgt für deren Ausschleusung aus dem Nukleus. Ihre regulatorische Funktion können die FoxOTranskriptionsfaktoren allerdings nur dann ausführen, wenn sie sich im dephosphorylierten Zustand im Nukleus befinden. In meinen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Psammaplysene A, ein natürliches Produkt aus dem Meeresschwamm Psammaplysilla sp., das Ausschleusen von FoxO1a aus dem Nukleus verhindern kann. Zusätzlich konnte aufgezeigt werden, dass die Schwammsubstanz sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen in vitro und in vivo beeinflusste. Voraussetzung hierfür war eine verminderte Zyklin D1 Expression, die den Eintritt der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus verhinderte. Eine Psammaplysene A-analoge Substanz namens F10 beeinflusste auf ähnliche Weise das Verhalten der glatten Gefäßmuskelzellen. Durch die simultane Verabreichung von Psammaplysene A und F10 konnten die Einzeldosen – bei gleich bleibender Wirkung auf die Zellen - reduziert werden. Dysfunktionen von pulmonalen Gefäßmuskelzellen legen den Grundstein für die Entwicklung von pulmonaler Hypertonie. In Teil 2 meiner Arbeit konnte gezeigt werden, dass FoxO1a sowohl die Proliferation und Migration, als auch den apoptotischen Zelltod von pulmonalen Gefäßmuskelzellen beeinflusst. Eine Transduktion dieser Zellen mit einer konstitutiv aktiven FoxO1a-Form führte zu einer stark verminderten Zellproliferation und -migration, wohingegen die Anzahl apoptotischer Zellen signifikant anstieg. Von allen pro-apoptotischen FoxO1a- Zielgenen konnte in diesen Zellen nur die Expression von Caveolin-1 als gesteigert aufgezeigt werden, und wurde somit als Hauptmediator der FoxO1a-vermittelten Apoptose identifiziert. Pathologisch veränderte pulmonale Gefäßmuskelzellen reagierten ähnlich wie normale Zellen auf die verstärkte Expression von inaktivem FoxO1a, was vielversprechend für eine zukünftige FoxO-bezogene Therapie bei pulmonaler Hypertonie ist. In Teil 3 konnte gezeigt werden, dass SIRT1 - eine Histondeazetylase der Klasse III, die für ihren Einfluss auf die Lebensdauer von Organismen bekannt ist – auch eine regulierende Funktion in arteriellen Gefäßmuskelzellen hat. SIRT1 sorgte hierbei für die Deazetylierung von FoxO Transkriptionsfaktoren, die daraufhin eine verstärkte Transkriptionsaktivität aufwiesen. Unter natürlichen Bedingungen interagierten beide Proteine physiologisch miteinander. Eine pharmakologische Inhibition der SIRT1-Aktivität brachte, genauso wie eine siRNA-vermittelte Runterregulation von SIRT1, eine reduzierte FoxO1a-Aktivität mit sich. Im Gegensatz dazu führte eine Behandlung mit dem SIRT1-Aktivator Resveratrol zu einer verstärkten transkriptionalen Aktivität von FoxO1a. Unter oxidativem Stress verstärkte sich die beobachtete SIRT1/FoxO1a-Interaktion noch weiter. Die dadurch gesteigerte Expression von an der Zellreparatur beteiligten Proteinen wie GADD45 erhöhte die Wahrscheinlichkeit eines Überlebens der Zelle. Die Gabe von Resveratrol schützte die glatten Gefäßmuskelzellen vor apoptotischem Zelltod, wohingegen eine Inhibition der SIRT1 Aktivität durch pharmakologische Substanzen oder siRNA zu einer Verstärkung der Apoptose führte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass embryonische Fibroblasten aus SIRT1-defizienten Mäusen resistenter gegenüber oxidativem Stress und der dadurch induzierten Apoptose waren als vergleichbare Wildtyp-Zellen