Investigation of the role of PKC-alpha for influenza A virus-induced signalling and of the inhibitory effect of Verapamil on virus replication

Influenza Virus (IV) activates the Raf/MEK/ERK-(MAPK) cascade late in their replication cycle. This is essential for efficient nuclear RNP-export and therefore for production of infectious IV. To characterize cellular factors involved in MAPKactivation in the context of the viral infection I recently analyzed the role of PKC-alpha. The results so far indicate, that activation of the Ca2+ activated PKC-alpha is involved in the IV induced MAPK-signaling and that specific inhibition of this function using a Ca2+ channel blocker (Verapamil) at non toxic concentration, negatively affects IV propagation (265). In addition, I have now further analyzed the action of Verapamil for possible additional negative effects on IV replication. Therefore I have investigated viral protein production in IV infected human lung epithelial cell line A549 and found that PB1, NP, and NS1 production is significantly reduced in IV infected and Verapamil treated A549 cells. Cell survival and cellular protein production does not seem to be affected ruling out a general effect of Verapamil on translation. Since PB1 is a functional important subunit of the viral polymerase the activity of the polymerase might be affected. Therefore I analyzed the polymerase activity in Verapamil treated cells for the production of viral mRNA using primer extension analysis of a reporter transcript expressed by either a plasmid based replication system or in virus infected cells. My current results show that viral mRNA production in the plasmid based replication system is not affected, while it seems to be reduced in virus infected cells. This indicates that Verapamil might alter viral transcription activity in virus infected cells. Taken together, PKC-alpha plays an important role in transmitting the influenza virus induced signal to the MAPK-cascade. As this PKC-alpha inhibition can be achieved at nontoxic Verapamil concentration, leading to strong reduction of virus titers, inhibition of this cellular activity might be a potential anti-viral therapy.Influenzaviren (IV) aktivieren die Raf/MEK/ERK (MAPK)- Signaltransduktionskaskade in der späten Phase ihres Replikationszyklus. Dies ist essentiell für einen effizienten RNP-Kernexport und damit für die Produktion infektiöser Viren. Zur Charakterisierung zellulärer Faktoren, welche im Kontext der viralen Infektion die MAPK-Kaskade aktivieren, habe ich die Rolle von PKC-alpha analysiert. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, daß die Aktivierung der Ca2+-aktivierten PKC-alpha an der virusinduzierten MAPK-Aktivität beteiligt ist, und das die Inhibition dieser Funktion durch einen Ca2+-Kanalblocker (Verapamil) in nicht toxischen Konzentrationen die IV-Vermehrung negativ beeinflußt (265). Zusätzlich habe ich weitere negative Effekte der Wirkung von Verapamil auf die IV-Vermehrung untersucht. Dafür habe ich die Produktion viraler Proteine in der IV-infizierten humanen Lungenalveolar-Epithelzellinie A549 analysiert. Dabei konnte ich zeigen, daß die Expression von PB1, NP und NS1 in infizierten und Verapamil-behandelten A549- Zellen signifikant reduziert ist. Dabei führt die Verapamil-Behandlung nicht generell zu einer Beeinträchtigung des Zellüberlebens oder einer verringerten Zellproteinproduktion. Da PB1 eine funktionell wichtige Untereinheit der viralen RNAabhängigen RNA-Polymerase (RDRP) ist, könnte die RDRP beeinflußt sein. Deshalb untersuchte ich die Produktion viraler mRNA. Zum einen in transfizierten A549-Zellen in denen mittels eines plasmidgestützen Replikationssystem zur transienten Expression viraler RDRP und eines vRNA-ähnlichen Pol1-Transkriopts virale mRNA gebildet wurde. Zum anderen wurde in transfizierten Zellen nur das vRNA-ähnliche Pol1- Trankript gebildet, welches dann durch die RDRP-Aktivität nach IV-Infektion der transfizierten Zellen repliziert und transkribiert wurde. Die jetzigen Ergebnisse der „Primer-Extension“-Analyse zeigen, daß die Produktion viralen mRNA in dem plasmidgestützten system nicht beeinflußt zu sein scheint, aber in den IV-infizierten Zellen. Das könnte bedeuten, daß Verapamil die virale Transkription in virusinfizierten Zellen beeinträchtigt. Zusammengefaßt kann man sagen, daß PKC-alpha eine wichtige Rolle in der Signaltransmission der IV-induzierten MAPK-Kaskade spielt. Da Verapamil in nicht toxischen Konzentrationen PKC-alpha inhibiert, die IV-Vermehrung hemmt und Verapamil als Pharmazeutika zugelassen ist, könnte Verapamil für einen anti-viralen therapeutischen Ansatz gegen IV nützlich sein