Charakterisierung der Interaktion der humanen Histon-Deacetylase 3 mit der MAP Kinase 11

In den letzten Jahren rückte die Regulation der \u27Genexpression\u27 in den Mittelpunkt vieler Forschungsarbeiten. Dabei wird untersucht, wie eine Zelle exakt bestimmen kann, welches Gen exprimiert und bei welchem Gen die Expression unterdrückt wird. Eine große Rolle bei der Aufklärung der Steuerung der Genexpression spielte die Entdeckung von Enzymen, die Einfluss auf das Acetylierungsgleichgewicht einer Zelle nehmen: Histon-Acetyltransferasen (HATs) führen zu einer Hyperacetylierung bestimmter Proteine, während Histon-Deacetylasen (HDACs) eine Hypoacetylierung hervorrufen. Diese (De-)Acetylierung findet an Lysinresten basischer Histone statt, die zusammen mit der DNA die Bausteine des Chromatins bilden. Dass Lysinreste an Histonen acetyliert werden können, wurde schon im Jahre 1964 von Allfrey und Kollegen herausgefunden. Die molekularen Hintergründe waren allerdings über Jahrzehnte unklar, denn humane Histon-Deacetylasen konnten erst vor einigen Jahren isoliert und charakterisiert werden. HDACs werden aufgrund ihrer Homologie zu Hefeproteinen in drei Klassen eingeteilt, wobei die erste Klasse von den HDACs 1, 2, 3 und 8 repräsentiert wird, welche zum Hefeprotein RPD3 (reduced potassium dependency) homolog sind. Die zweite Klasse, die aus den HDACs 4, 5, 6, 7, 9 und 10 gebildet wird, ist HDA1 (histone deacetylase 1) in der Sequenz ähnlich. Die dritte HDAC-Klasse wurde erst kürzlich entdeckt; sie ist homolog zum Hefeprotein SIR2 (silencing information regulator) und besteht aus den humanen Proteinen SIRT1-7. Der Einfluss von HDACs und HATs bei der Regulation der Genexpression ist heute unbestritten: Generell wird es Transkriptionsfaktoren und anderen regulatorischen Proteinen durch eine Hyperacetylierung ermöglicht, an die DNA zu binden und eine Genexpression zu induzieren, während eine Hypoacetylierung meist den gegenteiligen Effekt hervorruft. Die Bedeutung von HDACs in malignen Erkrankungen wurde ebenfalls in den letzten Jahren untersucht. Inzwischen sind eine Reihe von HDAC-Hemmstoffen entwickelt worden, die neben den üblichen Therapien im Kampf gegen Krebserkrankungen eingesetzt werden können. Die Forschungen hierzu sind allerdings noch am Anfang, und in der nächsten Zeit werden noch weitere Untersuchungen nötig sein. Die weitergehende Charakterisierung des Phänotyps der humanen Histon-Deacetylase 3 war Ziel der vorliegenden Arbeit. Es wurde zunächst versucht, neue Interaktionspartner von HDAC3 zu detektieren. Dabei wurden im Einzelnen folgende Ergebnisse erzielt: Mit der Far Western-Methode wurden verschiedene potenzielle Bindungspartner von HDAC3 identifiziert: Die MAP Kinase-Isoform p38 beta 2 (MAP Kinase 11), Rab3a, das zu der ras-Gen-Superfamilie gehört, das neuronale Protein SCG-10, sowie p38 delta (MAP Kinase 13), eine weitere Kinase-Isoform. Um einen möglichen Einfluss von HDAC3 auf die durch MAP Kinasen vermittelte Signaltransduktion aufzuzeigen, wurden weitere Versuche angeschlossen, wobei die Interaktion von HDAC3 mit der MAP Kinase 11 genauer untersucht wurde. In mehreren unabhängigen Experimenten wurde die Bindung der MAP Kinase 11 an HDAC3 durch Methoden wie Far Western-Analyse, Pulldown-Assay, Mammalian Two Hybrid-Analyse und Immunpräzipitationen bestätigt. Mittels Mutationsstudien konnte der Bereich der Interaktion zwischen HDAC3 und der MAP Kinase 11 auf den N-terminalen Bereich des HDAC3-Proteins eingegrenzt werden. HDAC3 vermindert außerdem in vitro und in vivo den Phosphorylierungsstatus der MAP Kinase 11. Zusätzlich wurde gezeigt, dass HDAC3 einen hemmenden Einfluss auf die Phosphorylierung und damit Aktivierung des Transkriptionsfaktors ATF-2 besitzt und die Expression von TNF alpha unterdrücken kann. Die Bindung der Proteine Rab3a, SCG-10 und sowie p38 delta an HDAC3 wurde ferner mittels Pulldown-Analysen bestätigt. Das zentrale Anliegen dieser Arbeit, den Phänotyp der humanen Histon-Deacetylase 3 weiter zu charakterisieren, konnte durch die Identifizierung neuer Interaktionspartner von HDAC3 erreicht werden. Es wurden mehrere Nicht-Histon-Proteine als Bindungspartner von HDAC3 detektiert. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass HDAC3 in der Zelle eine Rolle bei der MAP Kinase 11-vermittelten Signalübertragung spielt sowie an der Genexpression proinflammatorischer Zytokine beteiligt ist. Dabei übt HDAC3 einen inhibitorischen Effekt aus, der aber durch die Gabe von spezifischen Hemmstoffen wieder aufgehoben werden kann