Untersuchungen zum Infektionsmechanismus von Eimerien

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte kokzidieller Infektionen in vitro untersucht. Mechanismus der Zellinvasion In vitro konnte bei E. bovis-Infektionen oft beobachtet werden, dass Sporozoiten ihre Wirtszelle wieder verlassen, um eine neue Zelle zu befallen. Mit Hilfe einer Standardmethode zum Nachweis von Verletzungen der Zellmembran wurde gezeigt, dass E. bovis-Sporozoiten in bovine Endothelzellen eindringen können, indem sie deren Plasmamembran durchbrechen. E. bovis-Sporozoiten befielen auch VERO- und HT29-Zellen, jedoch offensichtlich ohne deren Zellmembran zu verletzen. Auch bei der Invasion boviner Endothelzellen durch Tachyzoiten von T. gondii bzw. N. caninum kam es nicht zu Verletzungen der Zellmembran. In Übereinstimmung mit einem Bericht über Plasmodium yoelii könnte dieser Mechanismus der Zellinvasion ein gemeinsames Merkmal der Kokzidien-Sporozoiten, nicht aber der -Merozoiten sein. Permeabilität der Parasitophoren Vakuole Bei E. bovis-infizierten VERO-Zellen boten die membrangängigen AM-Ester der ionensensitiven Farbstoffe eine nichtinvasive Methode zur Untersuchung der Permeabilität der Membran der Parasitophoren Vakuole (PVM) und gleichzeitigen Messung von pH und [Ca2+] in Parasit, Parasitophorer Vakuole (PV) und Wirtszelle. Die Verteilung der Fluoreszenzfarbstoffe in diesen Kompartimenten infizierter Zellen sprach gegen die Existenz nichtselektiver Poren in der PVM. Auch für die Existenz einer Verbindung zwischen PV und extrazellulärem Medium (\u27parasitophorous duct\u27) gab es keine Hinweise. Intrazelluläre Ionenkonzentrationen und Signalwege Während der pH innerhalb von PV und Parasit leicht niedriger war als im Zytosol der E. bovis-infizierten VERO-Zellen, unterschied sich die [Ca2+] in diesen Kompartimenten nicht signifikant. In keinem der untersuchten Modelle unterschied sich die [Ca2+]i infizierter Zellen von der in nicht infizierten Kontrollzellen. Ein Hinweis auf einen Einfluss auf Signalwege der Wirtszelle zeigte sich im Rahmen der eingesetzten Kokzidien nur in E. separata-infizierten HT29-Zellen. Hier war 24 Stunden nach der Infektion die Ca2+-Antwort auf extrazelluläres ATP signifikant reduziert. Patch-Clamp-Experimente mit E. bovis-infizierten Zellen Die untersuchten Parasit-Wirtszell-Modelle waren für Patch-Clamp-Untersuchungen nicht gut geeignet. Bei den E. bovis-infizierten BSLEC stellte sich die langsame Entwicklung der Sporozoiten als Problem heraus. Intrazelluläre Sporozoiten reagierten auf die Manipulationen der Patchpipette an der Wirtszelle und begannen sich zu bewegen, was dann zum Verlust des Seals führte. Ganzzellableitungen an späteren Stadien scheiterten, da die Wirtszellen dann in engem Kontakt zu den Nachbarzellen standen. Die elektrische Kopplung benachbarter Zellen (über gap junctions) verhinderte Ganzzellableitungen. Kalzium-induzierter Egress von Kokzidien aus Wirtszellen In der Literatur gibt es einige Berichte darüber, dass die Erhöhung der [Ca2+]i der Wirtszelle den Egress des Parasiten provoziert. In allen diesen Fällen wurde die [Ca2+]i allerdings mit Hilfe von Kalziumionophoren oder durch Mikroinjektion so stark und anhaltend erhöht, wie es in einer intakten Zelle niemals vorkommt. In dieser Arbeit wurde am Beispiel von E. bovis-infizierten BSLEC zum ersten mal gezeigt, dass eine physiologische Erhöhung der [Ca2+]i der Wirtszelle (nämlich ein durch Stimulation purinerger Rezeptoren ausgelöstes intrazellulären Ca2+-Signal) genügt, um den Egress eines Parasiten zu provozieren. Außerdem wurde gezeigt, dass die Freisetzung von N. caninum-Merozoiten aus reifen Schizonten ebenfalls durch ein solches Ca2+-Signal der Wirtszelle induziert werden kann.In this study, different aspects of coccidial infections have been investigated in vitro. Alternative mechanism of cell invasion In vitro, Eimeria bovis sporozoites often could be observed leaving their host cell to invade a new one. Contrary to the classical way of infecting a cell by forming a parasitophorous vacuole, a standard \u27cell wound assay\u27 has shown that E. bovis can invade bovine endothelial cells by breaching the plasma membrane. E. bovis sporozoites also infected VERO and HT29 cells but obviously without damaging the plasma membrane. Neither did tachyzoites of Toxoplasma gondii and Neospora caninum breach the host cells plasma membrane when infecting bovine endothelial cells. According to a literature report dealing with Plasmodium yoelii sporozoites, breaching the membrane of certain host cells may be a common phenomenon for coccidian sporozoites, but may not be for merozoites. Permeability of the parasitophorous vacuole membrane (PVM) Loading E. bovis infected VERO cells with membrane permeant AM-esters of ion sensitive dyes provided a non-invasive method for investigation of the permeability of the PVM and simultaneous measurement of Ca2+ and H+ concentrations inside the parasite, the vacuolar space and the host cell. The distribution patterns of the cleaved membrane impermeant dyes argue against the existence of nonselective pores in the PVM. There is also no indication for a parasitophorous duct connecting the vacuolar space with extracellular media. Intracellular ion concentrations and signalling The pH inside the PV and the parasite was lower than in the cytoplasm of the VERO host cell, whereas the [Ca2+] in these compartments did not differ significantly. In none of the investigated parasite-host cell-models, the [Ca2+]i of infected cells differed from noninfected controls. In HT29 cells infected with E. separata for 24 h the Ca2+ response to extracellular ATP was significantly reduced, indicating influences on the host cell’s intracellular signalling. Patch clamp studies on E. bovis-infected cells The accessibility of the investigated parasite-host cell models to patch clamp studies was rather limited. The slow development of E. bovis sporozoites in BSLEC cells turned out to be a problem. In early stages, manipulation on the host cell with the patch pipette led to movements of the intracellular sporozoite which resulted in the loss of the seal. With ongoing development of the intracellular parasite, host cells grew more and more confluent and, by means of electric coupling via gap junctions, became inaccessible for whole cell recordings. Calcium induced egress of coccidia from host cells It is reported that elevation of host cell [Ca2+]i provokes parasite egress. But, in all studies dealing with Ca2+ triggered Egress, [Ca2+]i was excessively and sustained elevated by ionophores or microinjection, constituting conditions not to be found in intact living cells. Here, in E. bovis infected BSLEC cells, a moderate, physiologic elevation of [Ca2+]i evoked by purinergic stimulation was sufficient to provoke parasite egress. Furthermore, release of N. caninum merozoites from mature schizonts also could be induced by this purinergic activated Ca2+ signal