Molecular analysis of endo-rhamnogalacturonan hydrolases in Aspergillus.

Bij de enzymatische bereiding van appelsap spelen pectinolytische enzymen en met nar-ne de enzymen die inwerken op de 'hairy regions' van pectine (MHR), een belangrijke rot. Schimmels zijn belangrijke enzym-producenten en een aantal Aspergillus soorten worden veelvuldig gebruikt in de voedingsmiddelenindustrie. In dit proefschrift staat de afbraak van MHR door rhamnogalacturonan hydrolases centraal en de produktie van deze enzymen is uitgebreid onderzocht in zowel A. aculeatus, de producent van het commerciële enzympreparaat Ultra SP, als A. niger.De waarneming van een endo-enzymactiviteit in Ultra SP, welke in staat is om MHR af te breken, betekende een doorbraak voor het inzicht in de wijze waarop pectine door schimmels wordt afgebroken. Tot dan toe waren alleen endo-enzymen bekend, die gericht zijn op de afbraak van homogalacturonan, zoals polygalacturonase, pectaat lyase en pectine lyase, en exo-enzymen, zoals galactosidase en arabinofuranosidase, die zich beperken tot de gedeeltelijke afbraak van MHR zijketens.Bij afbraak van MHR door rhamnogalacturonan hydrolase, worden tetra- en hexa- saccharide fragmenten uit de hoofdketen vrijgemaakt. Dit is niet geheel in overeenstemming met een alternerende volgorde van rhamnose en galacturonzuur in de hoofdketen en de herkenning van één van beide typen bindingen tussen deze monosacchariden door rhamnogalacturonan hydrolase. Blijkbaar vindt geen complete afbraak plaats en zijn voor verdere afbraak additionele endo-enzymen met andere specificiteiten nodig.In deze studie is allereerst het gen coderend voor rhamnogalacturonan hydrolase van A. aculeatus, rhg A, gecloneerd en het recombinant eiwit gezuiverd, zoals beschreven in hoofdstuk 2. Immunogene screening van een cDNA expressiebank resulteerde in een cDNA cloon, die vervolgens gebruikt werd als probe voor het screenen van een genomische bank.Kruishybridizatie van genomisch DNA van andere schimmelsoorten behorend tot de sectie Nigri met deze probe, resulteerde in meerdere hybridizerende DNA fragmenten en dus potentiële gen-families in alle stammen, maar vooral in A. niger. In eik van de onderzochte stammen werd tevens kruisreactiviteit met het polyclonale muize-antiserum, opgewekt tegen rhamnogalacturonan hydrolase van A. aculeatus, aangetoond. De betreffende eiwitten variëren in MW van 55 kDa in de verschillende onderzochte A. aculeatus en A. japonicus stammen tot 75 kDa in A. foetidus . De aanwezigheid van één rhamnogalacturonan hydrolase per stam leek niet in overeenstemming met de hybridizatie-patronen in de Southern analyse en tevens bleken deze enzymen algemeen binnen de sectie Nigri voor te komen.Het onderzoek naar rhamnogalacturonan hydrolase expressie werd daarom voortgezet in A, niger, een belangrijke producent van pectinolytische enzymen. In hoofdstuk 3 wordt de screening van het A. niger genoom naar sequenties homoloog aan het A. aculeatus rhgA gen beschreven. A. niger blijkt in het bezit te zijn van twee verwante genen, rhgA en rhgB. De hiervan afgeleide aminozuur sequenties vertonen ook, zij het in verschillende mate, overeenkomst met A. aculeatus rhamnogalacturonan hydrolase.Bij de vergelijking van de DNA sequenties bleken niet alleen de coderende gebieden, maar ook de aangrenzende, niet-coderende DNA sequenties homologieën te vertonen met het A. aculeatus gen. Beide rhg A promotoren hebben een box van 15 bp gemeenschappelijk en vertonen daarnaast 77% homologie over een traject van 130 bp. Mogelijk spelen deze elementen een regulerende rol bij de expressie van de verschillende rhamnogalacturonan hydrolase genen. De relatief geringe hoeveelheid rhamnogalacturonan in pectine in combinatie met de complexe structuur, maken het tot een moeilijk afbreekbaar substraat in vergelijking met bijv. homogalacturonan, dat vrij toegankelijk is voor enzymatische afbraak. Een verwachte opeenvolging in expressie van rhamnogaiacturonan afbrekende enzymen na homogalacturonan afbrekende enzymen blijkt niet te worden bevestigd. De expressie van rhg A in zowel A. aculeatus als A. niger is relatief vroeg. De genen komen in beide stammen reeds tot expressie binnen 6 h na transfer naar appel pectine. Expressie van het rhgB gen in A. niger kan alleen worden aangetoond op mRNA niveau na multicopy integratie in het genoom en is zichtbaar na 18 h groei op appel pectine maar ook op sucrose.Mogelijke verklaringen voor de lage expressie niveaus in A . niger zijn hoge proteolytische activiteit in de gebruikte stam en hoge gevoeligheid voor proteolytische afbraak van de betreffende rhamnogalacturonan hydrolases. De laatste verklaring is het meest waarschijnlijk, daar vergelijkbare resultaten werden verkregen na transformatie van A . aculeatus met deze genen.De toepassing van een enzym als rhamnogalacturonan hydrolase maakt een goed produktie systeem noodzakelijk. In de hoofdstukken 2 en 3 wordt een produktie systeem in A.awamori beschreven, dat gebaseerd is op de endogene endo-xylanase promoter. Dit maakt de produktie van rhamnogalacturonan hydrolases op xylose mogelijk i.p.v. op appel pectine, waardoor een zuiverder produkt verkregen wordt.Enzymactiviteiten van de A. aculeatus en A . niger rhamnogalacturonan hydrolases zijn vergeleken d.m.v. incubatie met MHR als substraat en analyse van de verkregen afbraakprodukten. Het A . niger B-enzym blijkt extra oligomeren te vormen waarvan een aantal met hoger MW, duidend op een andere substraat specificiteit dan de A-enzymen. Remming van het B-enzym door acetyl-groepen of andere zijketens is nog niet onderzocht. Echter, de aanwezigheid van extra monosacchariden, afkomstig van hoofdof zij-ketens van MHR, in sommige van de gevormde produkten, suggereert dat er verschillen in sterische hindering bestaan tussen het B-enzym en de A-enzymen. Mogelijk is het B-enzym minder afhankelijk van enzymen die bijv. de arabinogalactan zijketens afbreken.De specifieke activiteit van de verschillende rhamnogalacturonan hydrolases is afgeleid van de initiële snelheid waarmee één van de hexameren (corresponderend met piek Vlll in Fig. 7, hoofdstuk 3) gevormd wordt. Ondanks de relatief lage expressie-niveaus van rhamnogalacturonan hydrolase A en B in A. niger, vertonen deze enzymen een specifieke activiteit van respectievelijk 30% en 25% van die van A . aculeatus rhamnogalacturonan hydrolase. Vergelijking met gepubliceerde rhamnogalacturonan hydrolase-activiteiten, bepaald in andere organismen, wordt bemoeilijkt door het gebruik van verschillende detectie-methoden.De hoge mate van conservering van aminozuursequenties in de verschillende enzymen maakt toekenning van potentiële functies aan specifieke aminozuren onmogelijk en behoeft verdere analyse d.m.v. 'site-directed' mutagenese.In Aspergillus is nog niets bekend over mechanismen die de expressie van pectinolytische genen reguleren. De produktie van een breed scala aan MHR afbrekende enzymen in A. aculeatus na groei op pectine, duidt op een efficiënte pectine afbraak. Hiervoor is een goed-gecoördineerd regulatie-systeem, specifiek gericht op de afbraak van rhamnogalacturonan structuren, noodzakelijk. Kennis van de genstructuur van rhamnogalacturonan hydrolase maakt tal van moleculaire studies mogelijk. Een start ter identificatie van trans-factoren, die betrokken zijn bij de regulatie van deze genen, is gemaakt d.m.v. UV mutagenese van A. aculeatus. In hoofdstuk 4 wordt de isolatie van mutanten met verhoogde rhamnogalacturonan hydrolase expressie beschreven. De screening is uitgevoerd m.b.v. A . niger glucose oxidase als reporter systeem. Aangezien appel pectine een geschikte C-bron bleek voor de inductie van rhamnogalacturonan hydrolase in vloeibare kweken, werd dit substraat in eerste instantie ook gebruikt voor de screening van mutanten op agar medium. Echter de complexiteit van het substraat bracht een aantal nadelen met zich mee, zoals achtergrond kleuring, mogelijk represserende effecten door de aanwezigheid van andere suikers of inhibitie van de kleurreactie door interactie van pectine bestanddelen met H ₂ 0 ₂ . Een alternatieve C-bron voor de inductie van rhg A, gebaseerd op de combinatie van twee hoofdbestanddelen van rhamnogalacturonan, galacturonzuur en rhamnose, bleek wel bruikbaar. Mutanten met verschillende expressie patronen na groei op een aantal verschillende C-bronnen werden geselecteerd en vier van de mutaties konden d.m.v. complementatie-toetsen worden toegekend aan verschillende loci. Blijkbaar vindt regulatie van rhg A expressie in A. aculeatus plaats via een complex mechanisme, waarbij tenminste vier verschillende loci zijn betrokken. Identificatie van de betreffende trans-factoren zal bijdragen tot het ophelderen van het regulatie systeem en de rol van galacturonzuur en rhamnose daarin, maar ook mogelijkheden bieden tot een verdere verhoging van de enzymproduktie.Aangezien rhamnogalacturonan hydrolases worden gebruikt in de levensmiddelenindustrie, is het belangrijk dat de identiteit van een geselecteerde produktiestam gewaarborgd is. Dit vereist een gedegen classificatie methode. Gezien de arbitraire resultaten verkregen na classificatie van A . aculeatus stammen met de huidige methoden, welke veelal gebaseerd zijn op morfologische kenmerken, bestond de noodzaak tot een andere aanpak. In hoofdstuk 5 wordt een RFLP methode beschreven, waarmee A. aculeatus kan worden onderscheiden van een aantal andere soorten binnen de sectie Nigri, inclusief de morfologisch verwante A. japonicus. De groep van A. aculeatus stammen blijkt erg heterogeen te zijn vergeleken met bijv. de A . japonicus groep. Echter, een onderverdeling in variëteiten binnen beide groepen is op grond van deze classificatie niet langer gerechtvaardigd. Een aantal voormalige A. aculeatus en A . japonicus stammen wisselen van groep. Gezien de overeenkomstige morfologische kenmerken die beschreven zijn voor A. aculeatus en A. japonicus stammen, wordt een gemeenschappelijke phylogenetische voorouder, anders dan die van A. niger, waarschijnlijk geacht. Dezelfde RFLP methode is gebruikt voor het classificeren van A. carbonarius stammen en kan met geringe modificaties ook gebruikt worden voor de classificatie van andere Aspergilli