Artificial control of protein activity

Cellen bestaan uit begrensde omgevingen met daarin een dichte opeenstapeling van talloze verschillende moleculen. Veel biologische processen verlopen hierin spontaan. Een strakke regulatie van eiwitactiviteit is daarom noodzakelijk voor het correct functioneren van een cel en is daarmee essentieel voor elk levend organisme. Het ontwerpen en bestuderen van kunstmatig gereguleerde eiwitten vergroot het begrip van natuurlijke metabolische processen en heeft belangrijke toepassingen in de synthetische biologie, en in het ontwerp en afgifte van medicijnen. Introductie van kunstmatige eiwitactiviteit in eiwitten maakt het bovendien mogelijk om schakelaars te ontwerpen wiens activiteit afhankelijk is van een externe stimulans of veranderingen in de omgeving en kan waardevol zijn voor het ontwerp van biosensoren. Dit proefschrift beschrijft ons werk in het veld van kunstmatige regulatie van eiwitactiviteit. Het eerste deel van het proefschrift focust op het ontwerpen van verschillende strategieën om kunstmatige regulatie van eiwitactiviteit te bewerkstelligen in zowel natuurlijke als kunstmatige enzymen. Een tweetal methodes wordt gepresenteerd om de herassemblage van twee inactieve fragmenten van een gesplitst enzym te faciliteren door middel van interactie met kleine moleculen en door middel van metaalion herkenning. Ook is een strategie gepresenteerd om een kunstmatig metaalenzym te activeren door middel van coördinatie van metaalionen. In het tweede deel van dit proefschrift is onderzocht hoe men controle kan uitoefenen over de functie van een eiwit. Een natuurlijk eiwit is hiervoor uitgerust met een katalytisch activiteit die deze van nature niet bezit. Op deze manier zijn er drie eiwitten, die behoren tot de familie van multidrug resistance regulatoren, ontworpen bestudeerd. De eiwitten zijn zo gebruik als bio-platform voor het ontwerp van kunstmatige metaalenzymen voor koper(II) gekatalyseerde asymmetrische reacties waarbij op verschillende wijzen de actieve transitiemetaalcomplexen zijn geintroduceerd..Cells are confined environments that contain numerous different, densely packed molecules and where many biological processes occur simultaneously. Therefore, tight control of protein activity is necessary for the correct functioning of the cellular machinery and is essential for every living organism. The study and design of artificially regulated proteins improves our understanding of natural metabolic pathways and has important applications in synthetic biology and drug design and delivery. Furthermore, introducing artificial regulation into proteins or enzymes allowed the design switches whose activity is dependent on external stimuli and/or changes in the environment and can be valuable for the design of biosensors.This thesis describes our work in the field of artificial control of protein activity. The first part of this thesis focuses on the design of artificial regulation strategies to modulate the activity of natural and artificial enzymes. First, two methodologies are presented to mediate the reassembly of two inactive fragments of a split enzyme for small molecules and metal ions recognition, respectively. A strategy to activate an artificial metalloenzyme by coordination of metal ions is also presented. In the second part of this thesis a distinct aspect of controlling protein function is explored that consists on the introduction of catalytic potential in proteins that do not show any native activity. In this context, three proteins belonging to the family of multidrug resistance regulators were studied for their use as scaffolds in the design of artificial metalloenzymes for Cu(II)-catalyzed asymmetric reactions