Mutational and biochemical analysis of Lactobacillus reuteri glucansucrase enzymes

α-Glucaan homopolysachariden worden door glucansucrase enzymen van melkzuurbacteriën gesynthetiseerd uit sucrose, en gebruikt als biologisch verdikkingsmiddel in de voedingsmiddelenindustrie, als bloedplasmavervanger in medische toepassingen, en als scheidingsmatrix in wetenschappelijk onderzoek. Echter, de α-glucanen geproduceerd door glucansucrasen zijn ook belangrijke pathogene factoren in tandbederf. Met behulp van specifieke remmers van glucansucrase enzymen zou tandbederf wellicht kunnen worden bestreden. In dit proefschrift hebben we het glucansucrase polysacharide syntheseproces in meer detail bestudeerd door de structuren van de initieel door het GTFA enzym van Lactobacillus reuteri 121 uit sucrose gevormde oligosachariden te karakteriseren. Uit deze gedetailleerde structuuranalyse bleek dat GTFA vooral lineaire oligosachariden synthetiseerde door verlenging van sucrose met een keten van glucose residuen met alternerende (α1→4) en (α1→6) bindingen. In dit PhD project werd een semi-rationele mutagenese benadering toegepast voor de modificatie van het glucansucrase GTF180 enzym, mogelijk gemaakt door de recentelijk opgehelderde kristalstructuur van het enzym. Dit stelde ons in staat om de essentiële gebieden voor bindingstype specificiteit en reactie specificiteit in het glucansucraseeiwit te identificeren. Verschillende residuen van domein B (L938, L940 en A978) en residuen van domein A (D1028, N1029, D1085, R1088 en N1089) bleken belangrijk te zijn voor bindingstype specificiteit. Residuen A978, D1028, D1085 en R1088 bleken betrokken te zijn bij de vorming van vertakkingen. Residuen N1029 en L981 zijn essentieel voor de transglycosyleringsreactie. De verkregen resultaten verschaffen nieuwe inzichten in de structuur-functie relaties van glucansucrase GTF180, met name in zijn bindingstype specificiteit, reactie specificiteit en enzymactiviteit.Bacteria are essential for mineralization processes on planet Earth. They live all around us, also on and in our body (skin, mouth, gut), acting amongst others to our food digestion. Lactobacilli are healthy and food grade bacteria. In our mouth they convert sucrose (table sugar) into a sticky biopolymer (α-glucan) using an enzyme (a protein biocatalyst) called glucansucrase. This biological glue allows them to adhere to teeth surfaces. If not brushed away their acid formation from sugar fermentation may cause teeth damage, ultimately resulting in dental plaque formation. I have studied the molecular roles of specific amino acids in the active site of glucansucrase. A large number of glucansucrase mutants that differed in crucial amino acid positions were constructed and characterized. This resulted in strong variations in the structures of the α-glucan products (linkage types, branching degree, and size). The results provide novel insights into structure-function relationships of glucansucrase enzymes and may contribute to future synthesis of tailor-made α-glucans (for food, medicine and research applications) and design of specific inhibitors (for tooth paste, mouth water)