Is TSE susceptibility in sheep influenced by RPSA gene variation?

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE’s) of prionziekten zijn een groep van dodelijke neurodegeneratieve ziektes die bij de mens en een breed scala van diersoorten voorkomen. TSE's worden veroorzaakt door besmettelijke abnormaal gevouwen eiwitten die prionen (PrPSc) worden genoemd. Wanneer een mens of dier wordt geïnfecteerd met prionen vindt een cascade van omzettingen plaats van het lichaamseigen cellulaire prioneiwit tot de abnormaal gevouwen vorm wat tot neurodegeneratieve symptomen en uiteindelijk de dood leidt. Bij schapen werd er een sterke variatie in scrapie resistentie gevonden tussen individuen die gedeeltelijk kan verklaard worden door het PRNP-genotype van het schaap. Andere kandidaatgenen kunnen echter ook een rol spelen in resistentie tegen scrapie. Bovendien kan de studie van genen die een rol spelen in de TSE pathway leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën die toegepast kunnen worden bij de mens. Een veelbelovend kandidaatgen is RPSA, een receptor die onder andere zorgt voor de binding en internalisatie van PrP in de cel. Structurele mutaties in dit gen kunnen leiden tot een vermindering van de bindingsaffiniteit tussen RPSA en PrP en kunnen daarom gevolgen hebben voor de pathogenese en verspreiding van de ziekte. Het RPSA eiwit maakt echter deel uit van een complexe gen familie die nog niet gekarakteriseerd is bij het schaap. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de literatuur over TSE’s, het RPSA gen en eiwit en priontherapieën. Hoofdstuk 2 bevat de doelstellingen van dit doctoraatsonderzoek. Het algemene doel was om alle leden van de RPSA genfamilie bij schapen te identificeren en te sequeneren en vervolgens hen te karakteriseren en te beoordelen op hun functionaliteit. Van alle functionele RPSA gen familieleden wilden we nagaan of structurele variatie in hun bindingsregio met PrP invloed heeft op de bindingsaffiniteit van de receptor, wat kan leiden tot verschillen in de resistentie voor TSE’s. We identificeerden en sequeneerden 12 RPSA gen familieleden bij het schaap in hoofdstuk 3.1. De reeds beschreven gedeeltelijke genomische sequentie van het functionele RPSA gen werd bevestigd en aangevuld met de ontbrekende sequentie. Naast het functionele RPSA gen, identificeerden we 11 nieuwe leden van de schapen RPSA genfamilie. Het waren allen geproceste pseudogenen waarvan 2 semi-geprocessed en ze werden RPSAP1-RPSAP11 genoemd. De RPSA familieleden werden vergeleken met het functionele RPSA transcript. De leden verschillen van elkaar in zowel structuur als percentage sequentie identiteit met het functionele RPSA transcript. Bovendien werd het transcriptie profiel van alle RPSA familieleden bepaald door RT-PCR in 7 weefsels. Een opmerkelijk resultaat is dat 6 van de 11 pseudogenen tot transcriptie komen in tenminste één van de geteste weefsels. De karakterisatie van de RPSA familieleden toonde aan dat geen enkel ander RPSA gen familielid, naast het actieve RPSA gen, kandidaat is om een effect te hebben op de binding tussen RPSA en PrP, hetzij als gevolg van de afwezigheid van expressie, lage sequentie identiteit met RPSA of de afwezigheid van bindingsdomeinen met PrP in het tot expressie komende polypeptide. In hoofdstuk 3.2 werden naast de 12 experimenteel gevonden RPSA familieleden nog eens 37 oviene RPSA familieleden geïdentificeerd in silico. Dit brengt het totaal op 48 oviene RPSA pseudogenen. Alle nieuw ontdekte RPSA familieleden zijn geprocessed, behalve 1 semi-geprocessed pseudogen en vertonen allemaal één of meer typische kenmerken van geproceste pseudogenen. Eens de sequenties van de RPSA pseudogenen bekend waren, was het mogelijk om een mutatiestudie uit te voeren op het functionele RPSA gen zonder interferentie van pseudogenen. We voerden de mutatie analyse uit op 33 niet-verwante schapen van 7 verschillende rassen. Er werden negentien mutaties gevonden maar geen enkele structurele mutatie die een directe rol zou kunnen spelen in de RPSA-PrP interactie. Bovendien werd aangetoond dat het RPSA eiwit van schapen, geiten en runderen 100% identiek is. Omdat er geen structurele variabiliteit van het oviene RPSA eiwit werd gevonden, wilden we onderzoeken of structurele variabiliteit van het PrP eiwit invloed kan hebben op de binding tussen RPSA en PrP, wat kan leiden tot verschillen in gevoeligheid voor prionziekten tussen soorten en binnen soorten. Om de bindingssterkte tussen RPSA en PrP moleculen van verschillende soorten te beoordelen werd in hoofdstuk 4 het klonen, de eiwitsynthese in E. coli en de zuivering van PrP en RPSA recombinante eiwitten van de mens, het rund en het schaap besproken. De resultaten van deze thesis tonen aan dat de geobserveerde variatie in scrapie resistentie bij schapen niet verklaard kan worden door structurele mutaties in het RPSA gen of in andere RPSA gen familieleden en dat de geobserveerde speciesbarrière tussen herkauwers voor bepaalde prion stammen niet verklaard kan worden door structurele verschillen in de RPSA eiwitten van verschillende herkauwers