Χρήση του κυανοβακτηρίου Synechococcus elongatus PCC 7942 στην επεξεργασία και αξιοποίηση υγρών αποβλήτων

Environmental conservation and climate change mitigation impose the need to investigate new routes for the treatment of wastewaters towards their valorization and mitigation of CO2 emissions. Wastewater streams contain valuable resources, such as water and nutrients, which are expected to become increasingly scarce for the foreseeable future. Due to their composition, wastewaters can be used as substrate for the cultivation of cyanobacteria, a sustainable feedstock for the production of biofuels and added value products. Cyanobacteria present higher photosynthetic activity than terrestrial plants and can remove/recover nitrogen and phosphorous from wastewater via assimilation into biomass, while fixating significant quantities of CO2 from atmospheric air or flue gases. This creates the opportunity for the development of processes that can offer tertiary wastewater treatment (nutrients removal) and CO2 emissions mitigation, while the generated biomass can be utilized in downstream valorization processes From the plethora of cyanobacteria that can potentially be used for WW treatment and valorization, this PhD thesis focuses on the monoculture of the freshwater cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 (S7942) on various nutrient-rich WW substrates. The cyanobacterium S7942 does not produce cyanotoxins and is of particular interest as a more sustainable alternative feedstock for the production of fuels, food and chemicals. In addition, the cyanobacterium S7942 can increase intracellular sucrose synthesis when exposed to saline conditions present in some WW streams, so it can be manipulated to produce high value-added biomass. Synthesized sucrose is a valuable ingredient as it can be used in various industrial applications, including bioethanol production. Furthermore, sucrose can be metabolically transformed by the cyanobacterium S7942 into biohydrogen through the biological "pathway" of anaerobic dark fermentation. However, cultivation of cyanobacteria in wastewater substrate and maintenance of monoculture constitutes a challenge for full scale application since both physicochemical parameters (temperature, nutrients depletion, etc.) and biological parameters (antagonistic species, predation etc.) may hinder culture growth. Moreover, the lack of extensive literature regarding the use of cyanobacteria for wastewater treatment/valorization and especially the lack of fundamental design and operational parameters for cyanobacteria-based processes renders their scaling up and implementation a difficult task.In this regard, an effort was made in this work (a) to propose proper low-cost disinfection techniques for the utilization of wastewater in the production of valuable cyanobacterial biomass, (b) to assess Synechococcus elongatus PCC 7942 adequacy for the treatment of secondary (biologically) treated industrial wastewater substrates (c) to provide critical design and operational data for the implementation of Synechococcus elongatus PCC 7942-based wastewater treatment process, as a supplementary or alternative tertiary wastewater treatment stage (d) to demonstrate the applicability of a Synechococcus elongatus PCC 7942-based wastewater treatment stage as a component for sustainable treatment and reuse of wastewaters that cannot be secondary treated due to the lack of organic constituents (evaluation in hydroponic WW).In the third chapter of the PhD thesis, efficient and low-cost wastewater media disinfection techniques for cyanobacteria cultivation are proposed. The disinfection techniques of filtration and chemical disinfection using NaClO or H2O2, as well as the novel and considered environmentally friendly disinfection method that is based on in-situ electrosynthesis of hexavalent iron species (ferrates), were evaluated individually or as a synergetic couple by measuring the removal of total viable count at 22oC (TVC). TVC is an indicative parameter for the presence of biological contaminants in an aqueous medium. The effect of filtration medium characteristics, of chemicals dosage and contact time were assessed as a guideline for the selection of filtration medium or/and chemicals’ dosage in full scale cyanobacteria cultivation applications, with special emphasis on the multilevel action of ferrates as disinfectant, as oxidant of organic compounds and as coagulant for the removal of turbidity and harvesting of cultivated biomass. The results showed that efficient disinfection for unhindered Synechococcus elongatus PCC 7942 proliferation can be achieved by coupling filtration at cutoff size ≤ 1.2 μm with chemical disinfection, preferably using ferrates produced via a Fe0/ Fe0 electrochemical cell in highly basic solution and by applying a dosage in terms of concentration-time (CT) ≥ 157 mg min L-1. Ferrates presented higher disinfection efficiency compared to the commonly used chemical disinfectants NaClO and H2O2 (Figure 2), while assisting in the removal of organic compounds (71-84% COD removal) and turbidity (89-97% removal) from wastewater media. Lowering turbidity increases light transfer efficiency in a photobioreactor (PBR), thus photosynthetic activity and biomass production. The respective NaClO and H2O2 dosage in the filtrated wastewater media for complete disinfection are CT ≥ 270 mg min L-1, significantly higher than that of ferrates. Disinfection efficiency presented moderate positive correlation (Corr. Coeff. = 0.611) with pore-size, having high statistical significance (p = 0.020), as well as moderate to very strong negative correlation (Corr. Coeff. = -0.700) with filter thickness, having very high statistical significance (p = 0.005). It is thus concluded that filter thickness, which affects filtration duration, has a greater effect on disinfection efficiency than that of filtering media’s pore size. Thus, in full scale applications, an ultrafiltration configuration or a slow sand filtration technique could be used as a low-cost preliminary disinfection process for the significant minimization of biological contaminants in wastewater-media.In the next chapter of the PhD thesis i.e., Chapter 4, properly disinfected high strength wastewater of different composition that had been subjected to aerobic biological treatment were used for the assessment of Synechococcus elongatus PCC 7942’s adequacy as a biological component for sustainable wastewater treatment applications. The growth rate of Synechococcus elongatus PCC 7942 was evaluated in relation to cultivation temperature, in order to identify the temperature thresholds for its efficient cultivation. Moreover, the impact of cultivation duration i.e., of hydraulic residence time (HRT), on growth and nutrients assimilation rates was evaluated. Valuable correlation coefficients (conversion factors) between the parameters that can express biomass concentration (chlorophyll a, total suspended solids, volatile suspended solids and optical density at 750 nm) were experimentally obtained. They are of great importance in the assessment, interpretation and implementation of research results by scholars and engineers, as well as for the dimensioning and adoption of the proposed technology. The results showed that Synechococcus elongatus PCC 7942 cultures in BG-11 media was assessed as a potent biological component for novel and sustainable biological nutrient removal processes for industrial wastewater treatment and valorization, as it can efficiently proliferate (a) in properly disinfected industrial wastewaters that have been subjected to biological treatment, (b) at a wide temperature range (16-32oC) and (c) at relatively high salinities of approximately 0.2 M NaCl, a salinity value that is not considered a threshold.The relative growth rate of all Synechococcus elongatus PCC 7942 cultures decreased over time regardless the growth media and the culture temperature, which is attributed to the obstruction of photosynthesis due to increased optical density in the PBRs and the subsequent intermittent flux of light as a result of mutual shading. This means that while increasing hydraulic residence time (HRT) i.e., PBR volume, leads to higher biomass yields, the efficiency of cultivation drops as an effect of increased culture density. Thus, the cultivation duration is managed by wastewater characteristics, PBR design and lighting configuration and must be carefully selected at case. The obtained results regarding the optimal operating temperature and salinity tolerance for Synechococcus elongatus PCC 7942 cultivation are considered suitable towards advantageous full-scale implementation of Synechococcus elongatus PCC 7942-based wastewater treatment technologies, since a plethora of wastewater streams have temperatures and salinities at these ranges. However, a balance between efficient nutrient removal/recovery, biomass production and PBR volume has to be established, which is highly affected by the effect of cultivation duration on Synechococcus elongatus PCC 7942’s growth rate and its nutrients assimilation rate. In this regard, not only the effect of cultivation period on biomass yields was evaluated, but its effect on nitrates removal by assimilation was additionally studied. An opportunity to elevate sustainability of WWTPs via implementation of a Synechococcus elongatus PCC 7942-based nutrient removal stage, individually or as a synergetic couple with denitrification process, is at site, since according to the comparative results between PBR and denitrification tank volume requirements, both volumes could be in the same order of magnitude. However, the lack of fundamental design and operational parameters hinders development, upscaling and implementation of cyanobacteria processes that are in compliance with circular economy and sustainability principles. In this regard, further study was conducted for dimensioning of a Synechococcus elongatus PCC 7942 cultivation PBR for different salinity wastewaters, which is presented in Chapter 5. The effect of salinity was examined in terms of its impact on cell productivity and nutrients assimilation rate, since both parameters affect PBR volume. Moreover, the salinity threshold of cultivation media may have significant implications regarding process’ applicability region, as well as its viability in terms of increased value of obtained phototrophic biomass. The response of cyanobacteria into stressors, such as salinity and nutrients availability can trigger metabolic responses that increase the intracellular assimilation of valuable products (metabolites) that can be used in green energy production, such as direct biohydrogen production, as well as in other economic sectors. The study revealed that cultivation of cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 can serve as tertiary treatment for nitrogen and phosphorous removal/recovery from wastewaters with salinities as high as 0.45 M NaCl offering the possibility of enhanced valorization of wastewater and of the produced biomass. At increased wastewaters salinities up to the experimentally obtained salinity threshold value of 0.45 M NaCl, despite the observed decline of cell productivity, nitrates removal rate remains constant, which is attributed to the metabolic changes of Synechococcus elongatus PCC 7942 leading to higher nitrogen assimilation in biomass. Salinity negatively affects cell productivity up to the point of completely inhibiting Synechococcus elongatus PCC 7942’s proliferation at salinities over 450 mmolNaCl L-1. Nonetheless, up until the salinity threshold of 450 mmolNaCl L-1, nitrates removal is relatively steady as a result of increased nitrogen assimilation in biomass, which is expressed as % TKN VSS-1 or SNUR. The higher SNUR values that are observed with increasing salinity, which along with cell productivity is one of the two experimentally obtained parameters for PBR dimensioning according to the proposed formula (Equation (1)), compensates the lower cell productivity observed at saline conditions (Figure 8) in a way that the PBR volume remains relatively constant regardless of salinity (volume change < 12 %). On the other hand, in the widely applied activated sludge (AS) denitrification processes the respective volume increases up to 260% analogously to salinity. It is concluded that photobioreactor volume can be at the same order of magnitude to an activated sludge denitrification reactor given an optimal cell productivity and favorable light intensity. Even at non-favorable growth conditions of limited lighting (5-30 μmol m-2 s-1) the resulting photobioreactor volume in comparable to activated sludge denitrification reactors. The salinity induced metabolic changes of Synechococcus elongatus PCC 7942 that lead to increase of SNUR are attributed to higher protein synthesis for the production of intracellular osmolyte (sucrose). The enrichment in sucrose content enhances biomass use as a raw material both for the industrial sector and the renewable energy sector. Therefore, a Synechococcus elongatus PCC 7942-based process can be adapted as a supplementary or an alternative treatment stage to the widely applied activated sludge denitrification processes.In Chapter 6, a Synechococcus elongatus PCC 7942-based treatment stage that can be used for the treatment of wastewaters that do not contain the necessary quantities of organic carbon needed for biological treatment in activated sludge treatment plants, such as those from hydroponic farms (HWW), is presented. A Synechococcus elongatus PCC 7942-based treatment stage can be a component of integrated management systems that are based on the principles of circular economy. Such a system was conceptualized and studied regarding the treatment of wastewater from hydroponic farms. These wastewater streams may constitute another substrate for cyanobacteria cultivation and the production of added value products or/and bioenergy, whereas if not properly managed they can become a serious threat for the environment.The proposed solution for the integrated management of HWW is based on (i) the reuse of HWW for the preparation of new feeding solution via an Electric Conductivity (EC)-control tool that rapidly quantifies chemicals dosage for enrichment, (ii) the treatment/utilization of HWW for the cultivation of cyanobacteria in a PBR and (iii) the advanced treatment of HWW or PBR effluents for reuse or disposal in the environment. The results showed that properly disinfected via filtration/chemical disinfection HWW from open or closed hydroponic system (OHS or CHS) constitute a potent cultivation substrate for unhindered and efficient Synechococcus elongatus PCC 7942 growth. An important finding is the positive correlation of the nitrogen assimilation rate and phosphorus assimilation rate with the concentration of nutrients in the culture medium. The higher the initial nitrate and phosphate concentrations, the greater the nutrient assimilation into the S7942 biomass, resulting in lower photobioreactor volume requirements.It is concluded that S7942 cultivation coupled with wastewater treatment can present an innovative nutrients removal stage with high potential for commercial and energy valorization of high salinity and/or high nutrient load wastewater. The proposed photobioreactor sizing methodology, which follows the design philosophy of activated sludge systems, can assist in the development, design and full-scale implementation of such innovative wastewater treatment and utilization stages following the principles of circular economy and sustainable development. Improving cell productivity by controlling culture conditions and exploiting intracellular sucrose of S7942 for the production of bio-hydrogen and/or other biofuels and/or chemicals, as well as co-processing of flue gases for CO2 capture/utilization are the next challenges that should be addressed.Η διατήρηση καλής περιβαλλοντικής ποιότητας και ο μετριασμός της κλιματικής αλλαγής επιβάλλουν την ανάγκη διάνοιξης νέων δρόμων στην επεξεργασία Υγρών Αποβλήτων (ΥΑ) προς την αξιοποίησή τους και τον μετριασμό των εκπομπών CO2. Τα ΥΑ περιέχουν πολύτιμους πόρους, όπως νερό και θρεπτικά συστατικά, τα οποία αναμένεται να γίνονται όλο και πιο σπάνια στο άμεσο μέλλον. Λόγω της σύνθεσής τους, τα YA μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα για την καλλιέργεια κυανοβακτηρίων, μια βιώσιμη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων και προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Τα κυανοβακτήρια παρουσιάζουν υψηλότερη φωτοσυνθετική δραστηριότητα από τα χερσαία φυτά και μπορούν να αφαιρέσουν/ανακτήσουν άζωτο και φώσφορο από τα ΥΑ μέσω αφομοίωσης στη βιομάζα, ενώ μπορούν να δεσμεύσουν σημαντικές ποσότητες CO2 από τον ατμοσφαιρικό αέρα ή/και απαέρια καύσης. Δίδεται η ευκαιρία λοιπόν για την ανάπτυξη διεργασιών που μπορούν να προσφέρουν τριτοβάθμια επεξεργασία ΥΑ (απομάκρυνση αζώτου και φωσφόρου) και μετριασμό των εκπομπών CO2 από μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων (ΜΕΥΑ), με παράλληλη παραγωγή πολύτιμης βιομάζας που μπορεί να αξιοποιηθεί στον ενεργειακό τομέα (πράσινη ενέργεια), στη χημική βιομηχανία (βιοσυστατικά), καθώς και στον αγροτοκτηνοτροφικό και διατροφικό τομέα. Από την πληθώρα των κυανοβακτηρίων που μπορούν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν για επεξεργασία και αξιοποίηση YA, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στη μονοκαλλιέργεια του κυανοβακτηρίου του γλυκού νερού Synechococcus elongatus PCC 7942 (S7942) σε διάφορα υποστρώματα YA με μεγάλη συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών. Το κυανοβακτήριο S7942 δεν παράγει κυανοτοξίνες, ενώ παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως μια πιο βιώσιμη εναλλακτική πρώτη ύλη για την παραγωγή καυσίμων, τροφίμων και χημικών ουσιών. Επιπλέον, το κυανοβακτήριο S7942 μπορεί να αυξήσει την ενδοκυτταρική σύνθεση σουκρόζης όταν εκτίθεται σε αλατούχες συνθήκες που υπάρχουν σε ορισμένα ρεύματα YA, επομένως μπορεί να χειραγωγηθεί για την παραγωγή βιομάζας υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η συντιθέμενη σουκρόζη είναι ένα πολύτιμο συστατικό, καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διάφορες βιομηχανικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής βιοαιθανόλης. Επιπλέον, η σουκρόζη μπορεί να μετασχηματιστεί μεταβολικά από το κυανοβακτήριο S7942 σε βιοϋδρογόνο μέσω του βιολογικού «μονοπατιού» της αναερόβιας σκοτεινής ζύμωσης. Ωστόσο, η καλλιέργεια κυανοβακτηρίων σε υπόστρωμα YA και η διατήρηση της μονοκαλλιέργειας αποτελεί πρόκληση για εφαρμογές πλήρους κλίμακας, καθώς τόσο οι φυσικοχημικές παράμετροι (θερμοκρασία, εξάντληση θρεπτικών συστατικών κ.λπ.), όσο και οι βιολογικές παράμετροι (ανταγωνιστικά είδη, μικρόβια θηρευτές κ.λπ.) μπορεί να εμποδίσουν την ανάπτυξη της καλλιέργειας. Επιπλέον, η έλλειψη εκτεταμένης βιβλιογραφίας σχετικά με τη χρήση κυανοβακτηρίων για επεξεργασία/αξιοποίηση ΥΑ και ιδιαίτερα η έλλειψη θεμελιωδών σχεδιαστικών και λειτουργικών παραμέτρων για διεργασίες που βασίζονται σε κυανοβακτήρια καθιστά την εφαρμογή τους δύσκολη αποστολή.Από την άποψη αυτή, έγινε προσπάθεια στην παρούσα διδακτορική διατριβή (α) να προταθούν κατάλληλες τεχνικές απολύμανσης χαμηλού κόστους για τη χρήση των λυμάτων στην παραγωγή πολύτιμης κυανοβακτηριακής βιομάζας, (β) να αξιολογηθεί η επάρκεια του κυανοβακτηρίου S7942 για την επεξεργασία/αξιοποίηση δευτερογενώς (βιολογικώς) επεξεργασμένων υποστρωμάτων βιομηχανικών ΥΑ, (γ) να εκτιμηθούν και να παρουσιαστούν κρίσιμα σχεδιαστικά και λειτουργικά δεδομένα για την εφαρμογή της διεργασιών επεξεργασίας ΥΑ με βάση το κυανοβακτήριο S7942, ως συμπληρωματικό ή εναλλακτικό στάδιο επεξεργασίας ΥΑ για απομάκρυνση αζώτου και φωσφόρου και (δ) να αποδειχθεί η δυνατότητα εφαρμογής ενός σταδίου επεξεργασίας ΥΑ με βάση την καλλιέργεια S7942 και να αξιολογηθεί το εν λόγω στέλεχος ως συστατικό για βιώσιμες διεργασίες επεξεργασίας και επαναχρησιμοποίησης ΥΑ που δεν μπορούν να υποστούν δευτερογενή επεξεργασία λόγω έλλειψης οργανικών συστατικών (αξιολόγηση σε υδροπονικά YA).Στο τρίτο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής, προτείνονται χαμηλού κόστους τεχνικές απολύμανσης των υποστρωμάτων καλλιέργειας κυανοβακτηρίων που προέρχονται από ΥΑ. Οι τεχνικές απολύμανσης διήθησης και χημικής απολύμανσης με χρήση NaClO ή H2O2, καθώς και η νέα και θεωρούμενη φιλική προς το περιβάλλον μέθοδος απολύμανσης που βασίζεται στην επιτόπια ηλεκτροσύνθεση εξασθενούς σιδήρου (ferrates), αξιολογήθηκαν μεμονωμένα ή ως συνεργικό ζεύγος μέσω μέτρησης της απόδοσης απομάκρυνσης ολικού μικροβιακού φορτίου στους 22oC (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα - ΟΜΧ). Η επίδραση των χαρακτηριστικών του μέσου διήθησης, της δοσολογίας των χημικών και του χρόνου επαφής αξιολογήθηκαν για την επιλογή του μέσου διήθησης ή/και της δοσολογίας χημικών σε εφαρμογές καλλιέργειας κυανοβακτηρίων πλήρους κλίμακας. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην πολυεπίπεδη δράση του εξασθενούς σιδήρου ως απολυμαντικό, ως οξειδωτικό οργανικών ενώσεων και ως κροκιδωτικό κατόπιν αναγωγής του σε τρισθενή σίδηρο, και η οποία δράση υποβοηθά την απομάκρυνση θολερότητας, τη φωτοσύνθεση και τη συγκομιδή της καλλιεργούμενης βιομάζας από τους φωτοβιοαντιδραστήρες.Τα αποτελέσματα από τις πειραματικές δοκιμές που αφορούν στην απολύμανση των ΥΑ για χρήση τους ως υπόστρωμα καλλιέργειας κυανοβακτηρίων, τα οποία παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 3, έδειξαν ότι αποτελεσματική απολύμανση για ανεμπόδιστο πολλαπλασιασμό του κυανοβακτηρίου S7942 μπορεί να επιτευχθεί με τη συνδυαστική χρήση των τεχνικών της διήθησης, με διηθητικό μέσο διαμέτρου πόρων ≤ 1,2 μm, ακολουθούμενης από χημική απολύμανση, κατά προτίμηση με χρήση εξασθενούς σιδήρου (ferrates) παραγόμενου με ένα απλό ηλεκτροχημικό κελί Fe0/Fe0 σε ισχυρό βασικό διάλυμα και σε δοσολογίες εκφρασμένες ως προς το γινόμενο συγκέντρωσης με χρόνο επαφής (CT) ≥ 157 mg min L-1. Ο εξασθενής σίδηρος παρουσίασε υψηλότερη απόδοση απολύμανσης σε σύγκριση με τα ευρέως χρησιμοποιούμενα χημικά απολυμαντικά NaClO και H2O2, ενώ βοηθά στην απομάκρυνση οργανικών ενώσεων (έως 84% μείωση COD) και θολερότητας (έως 97% μείωση