Sequence- and structure guided engineering of proteins and enzymes for biotechnology and health applications

Proteins are highly diverse and sophisticated biomolecules that represent a cornerstone of biological structure and function and have been exploited in man-made applications for thousands of years. Those proteins that facilitate chemical reactions at physiologically relevant time-scales are referred to as enzymes. Understanding the connections between proteins’ functions and their structures, mechanisms and evolution allows to engineer them towards desired properties for various applications. The aim of the work presented in this thesis is to assess different protein engineering approaches and workflows in the context of health and biotechnology applications. Four proteins were studied and/or engineered towards different outcomes using either sequence‑based information, structural information or a combination thereof. In paper I a sequence-based approach was applied to optimise vaccine candidates for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS‑CoV‑2). Specifically, ancestral sequence reconstruction was used to generate highly stable and soluble antigens that could be produced in high quantities in a low-throughput and structure‑independent manner. These ancestral antigens interacted with antibodies from recovered patients and served as scaffolds to host a domain of the extant antigen to further enhance antibody engagement. Paper II and III applied enzyme engineering to terpene cyclases in a health and biocatalysis context, respectively. In paper II a structure-based approach was used to understand the fundamental principles underlying the catalytic mechanism of an enzyme in human steroid metabolism. Specifically, solvent access tunnels were identified and modified to probe the role of activation entropy in human oxidosqualene cyclase, which drastically modified the temperature dependence of catalysis. This finding may also have implications for engineering related plant enzymes for production of industrially relevant compounds in heterologous hosts. In paper III sequence- and structure based approaches were used together to engineer substrate specificity in a promiscuous bacterial terpene cyclase. Specifically, the structure of a stable reconstructed ancestor of spiroviolene synthase was determined in order to understand the molecular basis of substrate promiscuity and engineer highly selective variants that retained thermostability. The presented workflow is relevant for engineering these enzymes as biocatalysts for production of terpene-based high value compounds. In paper IV the metabolite regulation of a flux-controlling enzyme in the Calvin cycle was studied to eventually engineer it for enhanced growth of autotrophic production hosts. Specifically, interactions between a bifunctional cyanobacterial fructose‑1,6-bisphosphatase and a panel of metabolites were identified using a proteomics approach and verified by in vitro experiments. A synergistic regulation involving the enzyme’s redox state and glyceraldehyde 3‑phosphate was discovered, which has implications for integrated metabolic and enzyme engineering approaches involving this biocatalyst. In summary, the results presented herein highlight the utility of integrating several different engineering approaches for proteins used in health and biotechnology applications. Proteiner är mycket diversa och sofistikerade biomolekyler som representerar en hörnsten för biologisk struktur och funktion och har tagits till vara i tillämpade produkter sen flera tusen år tillbaka. De proteiner som underlättar att kemiska reaktioner händer under en fysiologiskt relevant tidsram kallas för enzymer. En förståelse av sammanhangen mellan proteiners funktion och deras strukturer, mekanismer och evolution möjliggör att utveckla åtråvärda egenskaper hos de olika tillämpningarna. Målet med det presenterade arbetet i denna avhandling är att granska olika inriktningar och arbetsflöden för att utveckla proteiner med tillämpningar i områdena hälsa och bioteknik. Fyra proteiner studerades och/eller utvecklades mot olika rön med hjälp av sekvensbaserad information, strukturbaserad information eller en kombination av dessa. I Artikel I tillämpades en sekvensbaserad inriktning för att optimera en vaccinkandidat mot severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2, svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus 2 på svenska). Konkret, så användes rekonstruktion av förfädersproteiner för att generera mycket stabila och lösliga antigener som kunde produceras i stora mängder. Metoden var inte beroende av att testa många proteiner eller strukturell information. Dessa förfädersantigener interagerade med antikroppar från tillfrisknade patienter och kunde användas som strukturell bas för att hysa en domän som tillhör ett nuvarande antigen med syftet att ytterligare förstärka antikroppsinteraktionerna. I Artikel II och III användes enzymteknik för att utveckla terpencyklaser med tillämpningar inom områdena hälsa respektive biokatalys. I Artikel II tillämpades en strukturbaserad inriktning för att förstå de fundamentala principerna som ligger till grund för en enzymmekanism inom den mänskliga steroid metabolismen. Konkret, så identifierades och modifierades accesstunnlar för vatten med syftet att studera aktiveringsentropins roll för humant oxidosqualencyklas, vilket ledde till en drastisk förändring i katalysens temperaturberoende. Denna insikt kan komma at ha betydelse för utvecklingen av relaterade växtenzymer med syfte att producera industriellt värdefulla kemiska föreninger i cellfabriker. I Artikel III användes sekvensbaserade och strukturbaserade metoder tillsammans för att utveckla substratspecificitet i ett bakteriellt terpencyklas som katalyserar flera reaktioner. Konkret, så löstes strukturen av ett stabilt, rekonstruerat förfädersenzym till spiroviolensyntas för att förstå den molekylära grunden till att enzymet kan katalysera flera reaktioner och för att utveckla mycket selektiva varianter med bibehållen termisk stabilitet. Det presenterade arbetsflödet är relevant för att utveckla dessa enzymer till industriella biokatalysatorer för att producera terpenbaserade kemiska högvärdesföreningar. I Artikel IV studerades hur ett enzym som kontrollerar flödet genom Calvincykeln regleras av metaboliter för att som slutmål utveckla Calvincykeln mot ökad produktion i autotrofiska produktionsvärdar. Konkret, så identifierades interaktionerna mellan ett bifunktionellt fruktos‑1,6-bisfosfatas från cyanobakterier och en utvald grupp metaboliter med hjälp av en proteomikmetod och verifierades sedan med hjälp av in vitro experiment. En synergistisk reglering upptäcktes som involverar enzymets redoxtillstånd och metaboliten glyceraldehyd 3-fosfat och som har konsekvenser för hur detta enzym behöver modifieras för att kunna appliceras inom metabolismteknik. Sammanfattningsvis visar resultaten i denna avhandling nyttan av att integrera flera olika ingenjörsmässiga strategier för att skräddarsy proteiner med tilllämpningar i hälsa och bioteknik. QC 2023-02-27