Bioprospecting microorganisms with potential for diesel oil bioremediation

A contaminação por hidrocarbonetos derivados do petróleo é uma das principais preocupações ambientais, devido a frequência de acidentes e aos impactos causados nos ecossistemas e na saúde. No Estado de São Paulo, a principal fonte de contaminação provém de postos de combustíveis, totalizando 70% das áreas registradas. Diante deste cenário, é necessário realizar o tratamento para reduzir ou eliminar os contaminantes. Processos de biorremediação têm se destacado como alternativas promissoras para a descontaminação ambiental. Dessa forma, este estudo teve como objetivo realizar a bioprospecção de micro-organismos de áreas contaminadas por óleo diesel e avaliar sua capacidade para biodegradação deste óleo por culturas puras. Para tanto, foram realizadas coletas de amostras com diferentes períodos de contaminação, em uma área de estacionamento de caminhões, que atuava como posto de combustível em Cubatão, São Paulo. A identificação da comunidade microbiana cultivável foi analisada através da técnica metabarcoding e a seleção dos micro-organismos degradadores do óleo diesel foi realizada por meio do enriquecimento seletivo, com óleo diesel como única fonte de carbono. Posteriormente, os micro-organismos foram isolados e identificados primeiramente através da espectrometria de massas e, posteriormente através da amplificação do gene 16S rRNA. O potencial para biodegradação do contaminante foi avaliado por meio de análise de oxirredução utilizando indicador 2,6 diclorofenol-indofenol (DCPIP) e confirmado por cromatografia gasosa (CG-FID). Ainda, a amplificação do gene alkB foi realizada para verificar a presença de uma das enzimas responsáveis pela biodegradação de hidrocarbonetos alcanos e a produção de biossurfactantes e enzimas extracelulares também foram avaliadas. A partir da análise metabarcoding, foi possível verificar diferença na composição dos micro-organismos dos diferentes pontos amostrais, sugerindo que o tempo de contaminação modula a microbiota do solo. Dessa forma, foi observada a abundância dos gêneros Bacillus, Acinetobacter e Pseudomonas nos diferentes pontos de coleta. Após enriquecimento com óleo diesel como única fonte de carbono, quatro cepas de cada ponto foram isoladas, com abundância do gênero Pseudomonas. Através da amplificação do gene alkB, foi possível detectar uma das enzimas responsáveis pelo metabolismo do óleo diesel (alcano monooxigenase), nas bactérias do gênero Pseudomonas, confirmando o potencial destas linhagens em degradar o óleo. Os isolados não apresentaram produção de enzimas extracelulares nem de biossurfactantes, evidenciando que o metabolismo ocorre apenas intracelularmente. Dentre os isolados, as cepas Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas koreensis, Acinetobacter soli e Ralstonia picketti apresentaram melhor eficiência em degradar o óleo diesel em 42,7; 40,8; 37,5 e 37,2%, respectivamente. Dessa forma, a utilização destas cepas pode ser uma alternativa para realizar a biorremediação de locais contaminados com óleo diesel, através da bioaumentação.Contamination by oil-derived hydrocarbons is one of the main environmental concerns, due to the frequency of accidents and the impacts caused on ecosystems and health. In the state of São Paulo, the main source of contamination comes from gas stations, totaling 70% of the registered areas. Given this scenario, it is necessary to perform treatment to reduce or eliminate contaminants. Bioremediation processes have been highlighted as promising alternatives for environmental remediation. Thus, this study aimed to perform the bioprospecting of microorganisms from areas contaminated by diesel oil and evaluate their capacity for biodegradation of this oil by pure cultures. To this end, samples were collected with different periods of contamination in a parking area, which operated as a gas station in Cubatão, São Paulo. The identification of the cultivable microbial community was analyzed by metabarcoding technique and the selection of microorganisms that degrade diesel oil was performed by selective enrichment with diesel oil as the only carbon source. After that, the microorganisms were isolated and identified first by mass spectrometry and later by amplification of the 16S rRNA gene. The potential for biodegradation of the contaminant was evaluated by oxireduction analysis using 2,6 dichlorophenol-indofenol indicator (DCPIP) and confirmed by gas chromatography (GC-FID). Also, amplification of the alkB gene was performed to verify the presence of one of the enzymes that are responsible for alkane hydrocarbon biodegradation and the production of biosurfactants and extracellular enzymes were also evaluated. The metabarcoding analysis showed a difference in the composition of microorganisms in the different sampling points, suggesting that the time of contamination modulates the soil microbiota. Thus, the abundance of the genera Bacillus, Acinetobacter and Pseudomonas was observed in the different collection points. After enrichment with diesel oil as the only carbon source, four strains were isolated from each point, with abundance of the genus Pseudomonas. Through amplification of the alkB gene, it was possible to detect one of the enzymes responsible for diesel oil metabolism (alkane monooxygenase) in bacteria of the genus Pseudomonas, confirming the potential of these strains in degrading oil. The isolates did not show production of extracellular enzymes or biosurfactants, showing that the metabolism occurs only intracellularly. Among the isolates, the strains Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas koreensis, Acinetobacter soli and Ralstonia picketti showed better efficiency in degrading diesel oil in 42.7, 40.8, 37.5 and 37.2%, respectively. Thus, the use of these strains can be an alternative to perform the bioremediation of sites contaminated with diesel oil, through bioaugmentation.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)CAPES: 88887.615272/2021-0