The epidermal growth factor receptor is a relevant host factor in the early stages of the Zika virus life cycle in vitro

Zika virus (ZIKV) is a member of the Flaviviridae family that received public attention and scientific interest after the outbreak in French Polynesia (2013-2014) and the epidemic in the Americas (2015-2016). Even though only 20% of infected people exhibit clinical manifestations and they are predominantly flu-like symptoms, these events unveiled neurological complications associated with ZIKV infection, such as the Guillain-Barré syndrome in adults and microcephaly in newborns. Lacking a preventive vaccine and a specific antiviral therapy against ZIKV allied to the fact that this pathogen is a re-emerging virus, uncovering and comprehending novel virus-host interactions is crucial to the identification of new antiviral targets and the development of innovative antiviral approaches. Previous research work uncovered that the Chinese hamster ovary (CHO) cells do not support ZIKV infection.459 As this cell line does not express endogenous epidermal growth factor receptor (EGFR), this study aimed to investigate whether EGFR and EGFR-dependent signaling are relevant for the ZIKV life cycle in vitro. In the first part of the study, viral infection was investigated in CHO cells and compared to A549 cells, a highly ZIKV permissive cell line. After performing binding and entry assays, ZIKV entry, but not the attachment, was significantly decreased in CHO cells in comparison to A549 cells. Additionally, in A549-EGFR KO cells, ZIKV entry was diminished relatively to the off-target control. These results show the clear impact that the absence of EGFR has on viral entry, implicating EGFR during this process. Even though EGFR overexpression in CHO cells could not render these cells permissive to ZIKV infection, as demonstrated by the lack of viral infection after electroporation with in vitro transcribed capped ZIKV-Renilla luciferase RNA, it was possible to rescue ZIKV entry. These findings suggest that there are additional elements, which are not expressed in CHO cells, required for viral replication. Furthermore, the impact of ZIKV infection on EGFR mRNA and protein levels as well as on the EGFR subcellular localization and distribution was evaluated. The relative number of EGFR specific transcripts continuously increased with ZIKV infection, whereas the EGFR protein level diminished at later times of infection. Moreover, changes in the subcellular localization of EGFR and its colocalization with the early endosomal marker EEA1 in ZIKV-infected cells revealed that ZIKV triggers EGFR internalization. The relevance of EGFR in the ZIKV entry process was further corroborated by the observation of EGFR internalization at 30 min post-infection (mpi) and to less extent at 60 mpi, which concurs with the expected time of ZIKV entry into the host cells. In the remaining part of the study, the influence of ZIKV infection in EGFR-dependent signaling as well as the contribution of EGFR and EGFR signaling for viral infection were studied. Activation of EGFR and the MAPK/ERK signaling cascade was detected as early as 5 mpi and ceased within 30 mpi in ZIKV-infected cells. Taking into account that EGFR internalization was observed at 30 mpi in infected cells, the activation of EGFR and ERK and subsequent dephosphorylation within this period go along with this previous observation. Vice-versa, inhibition of the activation of EGFR and the MAPK/ERK pathway declines ZIKV infection. On the one hand, inhibition of EGFR activation by Erlotinib affected ZIKV entry, as a consequence of impaired EGFR internalization. On the other hand, Raf and MEK inhibitors reduced ZIKV infection without disturbing viral replication or viral entry. These data suggest that the activation of the MAPK/ERK signaling cascade is necessary for a step of the viral life cycle before the onset of genome replication and morphogenesis and after viral entry. The importance of EGFR signaling was additionally investigated by the determination of EGFR half-life in ZIKV-infected cells upon EGF stimulation. While the EGFR half-life was similar in uninfected and Uganda-infected cells, a delay in EGFR degradation was observed in French Polynesia-infected cells. This observation might indicate an extended usurpation of the EGFR signaling since EGFR seems to still be active in the endosomes. Moreover, disruption of lipid rafts by MβCD, a cholesterol-depleting agent, hampered ZIKV entry. In uninfected cells, MβCD treatment led to the activation of EGFR, but at the same time prevented EGFR internalization, indicating that EGFR activation exclusively is not sufficient for an efficient ZIKV entry and further supporting the importance of EGFR internalization during the ZIKV entry process. Taken together, this study uncovers EGFR as a relevant host factor in the early stages of ZIKV infection, providing novel insights into the ZIKV entry process. Since numerous monoclonal antibodies and substances that target EGFR are licensed, repurposing these compounds might be a helpful tool for the establishment of an antiviral therapy in case of ZIKV re-emergence.Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein hochtransmissives Virus, das zur Gattung Flavivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae gehört. Andere Flaviviren, die eng mit ZIKV verwandt sind, sind Krankheitserreger mit erheblicher Bedrohung für die menschliche Gesundheit, wie unter anderem das Gelbfiebervirus und das Denguevirus. Im April 1947 wurde ZIKV bei einer Gelbfieber-Studie im Zika-Wald in Uganda entdeckt. In den folgenden 60 Jahren verbreitete sich das ZIKV nur gering mit einer niedrigen Anzahl von gemeldeten Fällen, aber erhöhten serologischen Nachweisen. Der erste ZIKV-Ausbruch ereignete sich 2007 auf der Insel Yap in den Föderierten Staaten von Mikronesien und betraf schätzungsweise 75 % der Bevölkerung. Trotz der Entdeckung im Jahr 1947 hat ZIKV aufgrund des Ausbruchs in Französisch-Polynesien (2013-2014) und der Epidemie in Amerika (2015-2016) erst in den letzten 10 Jahren die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft auf sich gezogen. Obwohl nur 20 % der Infizierten klinische Manifestationen aufwiesen und es sich überwiegend um grippeähnliche Symptome handelte, zeigten sich auch neurologische Komplikationen im Zusammenhang mit einer ZIKV-Infektion, wie das Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Neugeborenen. Als Arbovirus wird ZIKV hauptsächlich durch den Stich einer infizierten Mücke der Gattung Aedes übertragen. Die Übertragung kann jedoch auch direkt von Mensch zu Mensch durch Körperflüssigkeiten erfolgen, einschließlich von einer schwangeren Frau auf den Fötus über die Plazenta, Geschlechtsverkehr und Blutaustausch. Die schnelle weltweite Expansion des ZIKV und die Zunahme der dokumentierten Fälle von Mikrozephalie haben dazu geführt, dass die Weltgesundheitsorganisation im Februar 2016 das ZIKV zum öffentlichen Gesundheitsnotstand von internationaler Bedeutung erklärt hat. Dieser dauerte jedoch aufgrund des drastischen Rückgangs der Zahl der gemeldeten ZIKV-Fälle nur etwa 8 Monate an. In Ermangelung eines präventiven Impfstoffs und einer spezifischen antiviralen Therapie gegen ZIKV und der Tatsache, dass es sich bei diesem Erreger um ein wiederkehrendes Virus handelt, ist das Aufdecken und Verstehen neuer Virus-Wirt-Interaktionen entscheidend für die Identifizierung neuer antiviraler Angriffsziele und die Entwicklung innovativer antiviraler Ansätze. Wie andere Flaviviren besitzt ZIKV ein einzelsträngiges RNA Genom mit positiver Orientierung und einer Größe von ca. 11 kb. Das virale Genom kodiert für ein einzelnes Polyprotein, das von viralen und Wirtsproteasen in drei strukturelle Proteine – Kapsid (C), Hülle (E) und Vorläufer von Membran/Membran (prM/M) – und sieben nicht-strukturelle Proteine (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5) prozessiert wird. Das Viruspartikel besteht aus einem inneren Kern/Nukleokapsid, das von der genomischen RNA und dem C-Protein gebildet wird. Anschließend wird das Nukleokapsid von einer Lipiddoppelschicht umgeben, die mit E- und M-Proteinen beschichtet ist. Der virale Zyklus ist noch nicht vollständig erforscht. Er beginnt mit der Interaktion des viralen E-Glykoproteins mit mehreren Zelloberflächenmolekülen, um in die Wirtszelle einzudringen. Somit stellt der virale Eintritt ein attraktives Ziel für die Entwicklung antiviraler Strategien dar. Es wurden mehrere Moleküle beschrieben, die den Eintritt von ZIKV in den Wirt vermitteln, einschließlich AXL. Dies ist jedoch immer noch ein rätselhafter Prozess, der nicht vollständig verstanden ist. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ist ein Mitglied der ErbB/HER-Familie innerhalb der Superfamilie der Rezeptortyrosinkinasen (RTKs). EGFR besteht hauptsächlich aus einer extrazellulären Rezeptordomäne, die durch Bindung spezifischer Liganden das Signal in die Zelle weiterleitet. EGFR besitzt eine hydrophobe Transmembrandomäne, eine intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne und eine C-terminale regulatorische Schwanzdomäne. Eine beträchtliche Anzahl von EGFR-Molekülen und anderen Rezeptoren ist in Lipid-Rafts lokalisiert, da ihre Funktion bei der Signaltransduktion eng mit der Lokalisierung in diesen Mikrodomänen der Plasmamembran korreliert. Bei der Ligandenbindung dimerisiert ein einzelner Rezeptor mit einem anderen EGFR oder einem anderen Mitglied der ErBb-Familie, wodurch die intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne aktiviert wird. Folglich werden die im C-terminalen Schwanz des dimerisierten Rezeptors vorhandenen Tyrosinreste einer Auto- und Trans-Phosphorylierung ausgesetzt, was die Rekrutierung von Adapterproteinen und anderen Effektormolekülen begünstigt. Dies führt zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden, einschließlich der Ras-Raf-MEK-ERK (MAPK/ERK), JAK-STAT und PI3K-AKT-mTOR-Pfade. Um die zellulären Signale herunterzuregulieren und die Homöostase in der Zelle wiederherzustellen, verlässt EGFR die Lipid-Rafts und wird durch Clathrin-vermittelte Endozytose internalisiert. In den endosomalen Kompartimenten kann der internalisierte Rezeptor beim Recycling von Endosomen an die Zelloberfläche zurückgeführt werden oder wird einem lysosomalen Abbau unterzogen. Dieser Schritt ist abhängig von der Art des Liganden und von der Dauer und Intensität des Signals. Aufgrund der zentralen Rolle bei der Zellproliferation, dem Überleben, der Hemmung von Apoptose, Endozytose und dem Umbau des Zytoskeletts manipulieren mehrere Viren, darunter Mitglieder der Familie der Flaviviridae, EGFR, um die Plasmamembranbarriere zu überwinden und in den Wirt einzudringen, um Zugang zu den Replikationsstellen zu erhalten und sogar um antivirale Reaktionen des Wirts zu antagonisieren..