Proteomics: A close encounter with rheumatology

Rheumatoide artritis (RA) and spondyloartropathie (SpA) zijn twee frequent voorkomende vormen van inflammatoire artritis met een belangrijke morbiditeit en socio-economische impact op de samenleving. Alhoewel dezelfde gewrichten aangetast kunnen worden in beide aandoeningen, zijn de klinische verschijnselen verschillend. RA wordt als een aggressieve en destructieve gewrichtsaandoening beschouwd, integenstelling tot SpA dat veel minder erosief blijkt en waar bovendien pogingen tot herstel waargenomen worden. Desondanks worden zowel RA als SpA gekenmerkt door synovitis, de chronische ontsteking van het synoviaal membraan. Het synoviaal membraan bekleedt het gewrichtskapsel en is verantwoordelijk voor de homeostase van het gewricht. De ontsteking van dit delicate vlies kan accuut zijn door belasting en/of blessure, of er kan een chronische onstekingsreactie ontstaan waarvan, zoals in het geval van RA en SpA synovitis, de oorzaak ongekend is. Bij zowel RA als SpA ondergaat de synoviale architectuur van het aangetaste gewricht een aantal ingrijpende veranderingen. De inflammatoire initiatie gebeurt door de infiltratie van inflammatore cellen. Deze leiden tot een verdikking van het synoviaal weefsel, ten dele door de inflammatoire infiltratie, maar ook door de locale proliferatie van de synoviocyten. Deze hyperplasie resulteert in een hypoxische micro-omgeving geassocieerd met neovascularisatie. Ondanks diepgaand onderzoek naar de chronische natuur van synovitis, blijft de kennis omtrent het moleculair verschil tussen RA en SpA synoviale inflammatie gebrekkig. Dit project had de intentie om synovitis vanuit een ander perspectief te bekijken. Het overgrote deel van studies naar inflammatoire artritis hebben een histologisch of immunologisch karakter. Alhoewel deze analyses heel wat aspecten betreffende chronische ontsteking van het synoviaal membraan hebben opgehelderd, kan een meer moleculair, biochemische benadering een ander licht werpen op mogelijke verschillen tussen de RA en SpA synovitis aantonen. Daarnaast, kunnen dergelijke studies de beschreven verschillen in synoviale histologie verklaren en mogelijks een bijdrage leveren aan de zoektocht naar de oorzaak van de uiteenlopende klinische verschijnselen tussen de twee vormen van inflammatoire artritis. Dit project startte met een differentiële screening van de expressie van de synoviaal cytosolische eiwittten afkomstig van knie biopsie stalen verkregen bij RA, SpA en OA patiënten (hoofdstuk 1). De verkozen methode was een klassieke proteome analyse en dit gaf ons de mogelijkheid om het expressie patroon van honderden eiwitten terzelfdertijd te bestuderen. De resultaten van deze studie toonden aan dat het synoviaal cytosolisch proteome van SpA in vergelijking met RA uit eiwitten bestond met een uniek expressie profiel voor elke vorm van artritis. Eiwitten uniek voor RA of SpA synovitis werden vervolgens geïdentificeerd en proteïnen gerelateerd aan inflammatoire artritis werden aangetroffen. Gedurende deze analyse werd onze aandacht gevestigd op een groep van eiwit spots die in een uitgesproken vorm gegroepeerd lagen op de twee-dimensionele (2-D) gels. Deze groep van spots werd geïdentificeerd als het eiwit vimentine. Het verdere onderzoek naar de afkomst van deze cluster van spots werd beschreven is hoofdstuk 2 en bleek het resultaat te zijn van eiwit processing. Het is gekend dat vimentine verknipt kan worden door caspasen en de massaspectrometrie data afkomstig van de verschillende eiwiten uit de groep bestigde dit. Wanneer we echter dit proces in vitro wensten na te bootsen, vertoonden de fragmenten van vimentine een ander patroon. De fragmenten waren niet opgeschoven naar de zure kant van de 2-D gel zoals op het in vivo beeld van het synoviaal cytosolisch proteome. Een afwezigheid van een specifieke eiwit modificatie lag aan de basis van dit verschil. Citrullinatie, een modificatie waarbij een arginine omgezet wordt tot citrulline, veroorzaakt een shift op een 2-D beeld naar de zure kant en bovendien is gecitrullineerd vimentine een gekend autoantigen in RA. Om deze redenen werd de mogelijke aanwezigheid van deze modificatie onderzocht. Inderdaad, fragmenten van verknipt vimentine waren gecitrullineerd in cytosolische eiwit extracten van RA, in tegenstelling tot SpA, waar deze gemodificeerde fragmenten bijna volledig afwezig bleken te zijn. Deze resultaten zijn in strijd met het voorkomen van gecitrullineerd fibrinogeen, een ander gekend gecitrullineerd synoviaal eiwit, dat zowel in RA als SpA aangetoond is. Citrullinatie is een eiwit modificatie dat verwikkeld is in verschillende pathologieën en het komt voor in extreme omstandigheden aangezien het enzyme dat verantwoordelijk is voor de omzetting enkel geactiveerd wordt in hoge calcium concentraties. Men denkt dan onmiddellijk aan apoptose en inderdaad, er zijn rapporten die citrullinatie associëren met apoptose van bepaalde celtypes, echter de precieze volgorde van stappen in het proces is niet gekend. De vraag waarom gecitrullineerd vimentine zo prominent aanwezig is in het RA synovium en niet (of beperkt) in het SpA synovium blijft onbeantwoord. Een mogelijks verschil in apoptose of een betere opruiming van gecitrullineerde vimentine residues zou misschien aan de basis ervan kunnen liggen. Het verblijf van gecitrullineerd vimentine in het RA synovium is ongetwijfeld geassocieerd met de ontwikkeling en de hoge specificiteit van antilichamen tegen gecitrullineerde proteïnen (ACPA) in RA. Inderdaad, bijkomend in hoofdstuk 2 toonden we aan dat de aanwezigheid van autoantilichamen tegen gecitrullineerde fragmenten van vimentine specifiek was voor RA. Deze bevindingen wezen op een nieuw concept in de ontwikkeling van autoantilichamen in RA waarbij humorale autoimmuniteit, gericht op caspase geknipt and gecitrullineerde fragmenten van een intermediair filament in het synoviaal membraan, ziekte-specifiek is. Niet enkel apoptose, maar ook hypoxie is geassocieerd met citrullinatie. Dit werd voorheen gerapporteerd in astrocyten die geïncubeerd werden in hypoxische omstandigheden (2% O2) van verschillende duur waarbij er een verhoging van peptidyl arginine deiminase (PAD) en gecirullineerd gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) aangetoond werd. Het is gekend dat de getroffen gewrichten van RA patiënten hypoxisch zijn. Wegens de hyperplasie van het synoviaal weefsel wordt de afstand tussen de cellen en het nabijgelegen bloedvat groter. Hierdoor verkleint de zuurstoftoevoer naar de cellen waardoor een hypoxisch microklimaat gecreërd wordt. Als het zuurstofgehalte onder de 5% valt, neem hypoxie geïnduceerde factor- 1 (HIF-1) de controle over de transcriptie van meer dan 70 genen. In onze initële proteome analyse werden eiwitten geïdentificeerd die in hypoxie onder invloed staan van HIF-1. De transcriptie van alfa-enolase, aldolase A, triose fosfaat isomerase en ceruloplasmine (Cp); eiwitten die verhoogde expressie vertoonden in SpA in vergelijking met OA (hoofdstuk 1), wordt geïnduceerd door HIF-1. Aangezien het SpA gewricht gekenmerkt wordt door synovitis, kunnen we aannemen dat ook hier de synoviale omgeving hypoxisch is. Er zijn echter geen studies die dit onderzocht hebben. Toch is het beschreven dat het SpA synoviaal membraan sterk gevasculeerd is en de vorming van nieuwe bloedvaten is een gekend effect van hypoxie. Bovendien blijkt er een verschil in synoviale vasculatuur te zijn tussen RA en SpA waar men bij SpA een verhoogde hoeveelheid aan bloedvaten waarneemt. Een mogelijkse hypothese was dat de weefsel respons op hypoxie verschillend is tussen RA en SpA. Hiervoor werd de mogelijkheid van RA en SpA synoviale fibroblasten (FLS) onderzocht om vasculair endotheliale groeifactor (VEGF) en Cp, twee eiwitten die een rol spelen in angiogenese, te produceren in hypoxische omstandigheden (hoofdstuk 3). VEGF is beschreven als dé sleutelfactor in angiogenese en Cp bindt en vervoert koper; de belangrijkste cofactor voor factoren die instaan voor de vorming van nieuwe bloedvaten. Zowel VEGF, koper als Cp zijn verhoogd in serum en synoviaal vocht van patiënten met inflammatoire artritis. De resultaten toonden een verhoogde genexpressie van Cp en een hogere produktie van VEGF aan in SpA FLS in vergelijking met RA FLS, beiden gegroeid in hypoxische omstandigheden. Alhoewel er extra confirmerende experimenten op de agenda staan, suggeren deze data dat het beschreven verschil in synoviale vasculariteit tussen RA en SpA gedeeltelijk zou kunnen verklaard worden hierdoor. Finaal, in het laatste hoofdstuk (hoofdstuk 4) beschrijven we een zoektocht naar nieuwe synoviale autoantigenen specifiek in RA. RA is een autoimmuun ziekte gekarakteriseerd door de produktie van autoantilichamen. We hadden de mogelijkheid om de synoviale autoantigen te catalogeren door gebruik te maken van een grootschalige techniek zoals proteomics. Voor deze experimenten werden 30 RA en 30 non-RA serum stalen geïncubeerd ten opzichte van een synoviaal eiwit extract. De autoantilichamen aanwezig in het serum van RA patiënten waren gericht tegen dat de subunits van synoviaal fibrinogeen (vooral deen subunit). De data confirmeerden de resultaten van de groep van Prof. Serre. Additioneel identificeerden we ook synoviaal vimentine, gekend as het Sa-antigen, en carbonic anhydrase I als potentiële nieuwe synoviale autoantigenen. Door het gebruik van 2-D gel electroforese (2-DE) en door de specifieke karakteristieken van deze techniek konden we aantonen dat deze autoimmune eiwitten uit treinen bestonden van aaneensluitende spots afkomstig van het zelfde eiwit. Merkwaardig genoeg, vertoonden spots die zich aan de zure kant van deze spot trein bevonden, de hoogste specificiteit voor RA. Een modificatie, zoals citrullinatie kan dus cruciaal zijn in de ontwikkeling van autoimmuniteit en we toonden ook aan dat zowel fibrinogeenals gecitrullineerd waren. Er is een verschil tussen de beschreven studie in hoofdstuk 4 en wat reeds verschenen is in de literatuur omtrent synoviale autoantigenen. Door te vertrekken van een eiwit extract afkomstig van synoviaal weefsel afkomstig van RA patiënten benaderden de bekomen resultaten de in situ situatie in het inflammatoir gewricht, in tegenstelling tot het beschreven gebruik van in vitro gecitrullineerde cel extracten. Gedurende onze proteomics trip, zijn we met verschillende aspecten van synovitis in contact gekomen. Allen wezen ze in de richting van een moleculair verschil tussen RA en SpA synovitis. Expressie patronen van eiwitten, modificaties van eiwitten en de secretie ervan bleken specifiek te zijn voor elke vorm van inflammatoire artritis. We toonden aan dat proteomics een fascinerend instrument is om de biologie van synovitis uit te spitten en onderlijnen dat er nog steeds nood is aan 2-DE, het ‘oude werkpaard’ van de klassieke proteomics, die als enige de post-translationele modificatie zo knap in beeld kan brengen