Integrative characterization of ß-catenin activation in melanoma

La voie de signalisation Wnt/ß-caténine joue un rôle clé dans de nombreuses fonctions cellulaires durant le développement embryonnaire et dans l'homéostasie tissulaire chez l'adulte. Elle est fréquemment dérégulée dans le cancer, y compris dans le mélanome. Les gènes cibles de la signalisation Wnt/ß-caténine restent mal connus dans le mélanome et dans le mélanocyte. Dans ce projet de thèse, nous avons cherché à décrire une signature de l'activation de ß-caténine dans le mélanome, à identifier des gènes cibles potentiels de ß-caténine, à évaluer les conséquences de l'activation de ß-caténine sur la survie globale, à estimer la prévalence de l'activation de ß-caténine et à ré-analyser les propriétés biologiques associées à son activation. En utilisant des données publiques du projet The Cancer Genome Atlas (TCGA), nous avons identifié une sous-population de mélanomes présentant une activation de ß-caténine. Ces mélanomes sont porteurs d'altérations génomiques de CTNNB1 et APC connues pour activer la voie ß-caténine. (i) Une signature transcriptionnelle de 207 gènes a été obtenue en comparant les mélanomes avec activation de la voie ß-caténine liée aux altérations génomiques de CTNNB1 et APC et les mélanomes indemnes de ces altérations génomiques. Certains des gènes de cette signature sont des gènes cibles de ß-caténine déjà connus dans d'autres types cellulaires : AXIN2, APCDD1, NKD1, SP5, NOTUM, ZNRF3, CCND1 et PPARD. Notre étude suggère que cette régulation transcriptionnelle existe aussi dans le mélanome. (ii) Nous décrivons aussi quatre nouveaux gènes cibles candidats de ß-caténine, ceci dans le contexte du mélanome : SLC1A5, SLC7A11, SLC24A4, et MICAL2. (iii) Nous avons validé la régulation transcriptionnelle de l'expression de ces quatre gènes par ß-caténine dans trois lignées cellulaires indépendantes de mélanome humain après activation ou répression de la signalisation ß-caténine. (iv) Nous avons réévalué la prévalence de l'activation de ß-caténine dans le mélanome en utilisant deux techniques indépendantes. Dans un premier temps, nous avons réalisé une immunohistochimie ß-caténine sur tissue microarray (TMA) dans une large cohorte de 175 patients. Ensuite, nous avons estimé la prévalence des mélanomes avec activation constitutive forte de ß-caténine en utilisant la signature transcriptionnelle établie précédemment. (v) Dans la cohorte du TCGA, nous avons constaté que les mélanomes montrant une signature d'activation de ß-caténine avaient une survie globale significativement plus faible que les autres mélanomes. (vi) Des modifications de la prolifération et de la migration, deux mécanismes cellulaires majeurs impliqués dans l'oncogenèse, ont été évaluées en inhibant l'expression de ß-caténine ou des quatre gènes cibles candidats. La réduction de l'expression de SLC1A5 ou MICAL2 diminuait à la fois la prolifération et la migration. (vii) De plus, nous avons cherché à inhiber le programme transcriptionnel de ß-caténine. Au cours de l'activation transcriptionnelle dépendante de ß-caténine, ß-caténine recrute le complexe Mediator par une interaction directe avec MED12, une sous-unité du complexe Mediator. In vitro, nous avons montré que l'inhibition de MED12 dans une lignée cellulaire de mélanome récapitule l'effet de l'inhibition de ß-caténine sur la prolifération et la migration cellulaire. L'identification d'une signature transcriptionnelle d'activation de ß-caténine dans le mélanome, est une étape importante vers l'amélioration de la compréhension du rôle de ß-caténine au cours de la mélanomagénèse.The Wnt/ß-catenin signaling pathway plays a key role in several cellular functions during development and homeostasis and is commonly deregulated in cancer, including melanoma. Target genes of Wnt/ß-catenin signaling are still largely unknown in melanoma and melanocyte. In this PhD project, we aimed to generate a ß-catenin activation melanoma signature, to identify potential ß-catenin candidate target genes, to reevaluate the consequences of ß-catenin activation on the clinical outcome, to improve the characterization of the ß-catenin pathway activation in human melanomas, and to estimate the prevalence of ß-catenin activation and its associated biological properties. Using publicly available data from The Cancer Genome Atlas (TCGA), we successfully identified ß-catenin pathway activated melanomas. These melanomas demonstrated genomic alterations in CTNNB1 and APC, which are known to activate the ß-catenin pathway. (i) A signature of 207 genes was obtained from the comparison of ß-catenin activated and non-activated melanomas. AXIN2, APCDD1, NKD1, SP5, NOTUM, ZNRF3, CCND1 and PPARD are ß-catenin target genes already known in other cell types. These genes are also regulated by ß-catenin according to this 207-genes signature. (ii) We also reported four new candidate melanoma-specific target genes of ß-catenin: SLC1A5, SLC7A11, SLC24A4, and MICAL2. (iii) We have validated the transcriptional regulation of the expression of these four genes by ß-catenin in three independent human melanoma cell lines after activation and repression of the ß-catenin pathway. (iv) We reevaluated the prevalence of ß-catenin activation in melanoma using two independent techniques. First, we performed ß-catenin immunohistochemistry on tissue microarray (TMA) in a large cohort of 175 patients. Second, we estimated the prevalence of melanomas with high constitutive activation of ß-catenin using the transcriptional signature previously established. (v) In the TCGA cohort, we observed that melanomas showing a ß-catenin activation signature had a significant lower overall survival than other melanomas. (vi) Modifications of proliferation and migration, two major cellular mechanisms involved in oncogenesis, were tested in the presence of ß-catenin and the four genes of interest. It appears that reduction of SLC1A5 or MICAL2 expression reduced both proliferation and migration. (vii) In addition, we sought to inhibit the ß-catenin transcriptional program. During ß-catenin dependent transcriptional activation, ß-catenin recruits the Mediator complex through a direct interaction with MED12, a Mediator subunit. In vitro, we showed that the inhibition of MED12 in a melanoma cell line recapitulates the effect of ß-catenin on proliferation and migration. The identification of a ß-catenin activation transcriptional signature in melanoma, is an important step towards the comprehension of the role of ß-catenin during melanomagenesis