Deciphering plasmodium falciparum gametocytes interactions with erythroblastic island

Les gamétocytes de Plasmodium falciparum sont localisés dans le parenchyme de la moelle osseuse, plus précisément au niveau des îlots érythroblastiques. Ces niches hématopoïétiques sont constituées d'un macrophage central entouré d'érythroblastes en cours de développement. Les mécanismes par lesquelles les gamétocytes immatures séquestrent dans la moelle osseuse sont encore inconnus. Ce projet de thèse consiste à étudier deux hypothèses qui pourraient expliquer la nature des interactions entre les gamétocytes et les îlots érythroblastiques. La première hypothèse soutient que les érythrocytes infectés par des gamétocytes (EIG) peuvent adhérer aux érythroblastes de l'îlot via des interactions entre ligands et récepteurs. La seconde hypothèse propose que les parasites infectent directement les érythroblastes et que les gamétocytes s'y développent jusqu'à maturité. Afin d'étudier la première hypothèse, nous avons mis au point un protocole d'adhésion de cellules en suspension et nous avons pu montrer que les EIG immatures n'adhèrent ni aux lignées érythroïdes ni aux érythroblastes. Nous avons ensuite émis l'hypothèse que l'adhésion pourrait être due à des protéines appartenant à des familles multigéniques, comme c'est généralement le cas pour les phénomènes de cytoadhésion chez P. falciparum. La souche de laboratoire utilisée étant une population non clonale, elle n'exprime peut-être pas les variants protéiques qui pourraient être à l'origine d'une adhésion. En particulier, les protéines codées par la famille multigénique stevor ont été identifiées comme ayant des propriétés adhésives chez les stades asexués des parasites : ces protéines se lient à la glycophorine C (GPC) à la surface des érythrocytes. Les protéines STEVOR ont été identifiées à la membrane des EIG et la GPC est exprimée chez les érythroblastes: ainsi les protéines STEVOR pourraient être impliquées dans l'adhésion des EIG aux érythroblastes. Pour tester cette hypothèse nous avons évalué l'adhésion des EIG de plusieurs clones de parasites exprimant différentes protéines STEVOR connues pour leurs propriétés adhésives au stade asexué. Nous avons également généré une lignée transgénique qui surexprime une protéine STEVOR capable de se lier à la GPC. Cependant, aucune adhésion significative de ces EIG aux érythroblastes n'a pu être observée. Nous en avons conclu que la séquestration des gamétocytes immatures dans la moelle osseuse n'est probablement pas due à l'adhésion aux érythroblastes. Pour étudier la seconde hypothèse nous avons développé un protocole d'infection des érythroblastes par P. falciparum. Nous avons caractérisé le développement des gamétocytes au sein d'érythroblastes par microscopie à fluorescence et électronique : les gamétocytes hôtes des érythroblastes présentent des structures caractéristiques du stade sexué et exportent leurs protéines dans la cellule. De plus, nous avons montré que seuls les stades tardifs d'érythroblastes permettent le développement des gamétocytes. Les gamétocytes immatures se développent entièrement dans les cellules nucléées, aboutissant à la présence de gamétocytes matures dans les réticulocytes. Cependant le développement des érythroblastes tardifs est habituellement beaucoup plus cours que la maturation des gamétocytes, nous avons donc émis l'hypothèse que le parasite puisse retarder la différenciation érythropoïétique afin de finir sa maturation au sein d'une cellule nucléée. Nous avons confirmé cette hypothèse et avons montré que les vésicules extracellulaires (VE) sécrétées par le parasite pourraient être responsables de ce retard érythropoïétique. Cette étude suggère que les gamétocytes immatures pourraient séquestrer dans la moelle osseuse en infectant les stades tardifs d'érythroblastes et en retardant leur différenciation par sécrétion de VE. Une fois matures, les gamétocytes au sein des réticulocytes pourraient sortir dans la circulation sanguine et être disponibles pour la transmission au moustique.Plasmodium falciparum gametocytes have been shown to sequester and develop in the human bone marrow parenchyma, where they are enriched at erythroblastic islands. These specialized niches, where occurs the terminal erythroid differentiation, consist of a macrophage surrounded by differentiating erythroblasts. Sequestration mechanisms of immature gametocytes in the parenchyma remain unknown. This PhD project consists in addressed two hypothesis to explain gametocytes interactions with erythroblastic islands. The first hypothesis is that immature gametocytes could adhere to the erythroblasts composing the island. The second hypothesis is that the parasite could directly infect erythroblasts and develop in these nucleated cells. To address the first hypothesis, I have set up a cell-cell adhesion protocol and we have found that erythrocytes infected with immature gametocytes do not specifically adhere to erythroblasts or erythroid cell lines. We then hypothesized that adhesion could be due to proteins belonging to multigenic families, as it is generally the case for cytoadhesion in P. falciparum. Since the laboratory strain used is a non-clonal population, it may not express the protein variants that could cause adhesion. In particular, proteins encoded by the stevor multigenic family have been identified as having adhesive properties in asexual stages: these proteins bind to the glycophorin C (GPC) on the surface of erythrocytes. STEVOR proteins have been identified on the membrane of gametocyte infected erythrocytes and GPC is expressed in erythropoietic precursors: thus STEVOR proteins could be involved in the adhesion of immature gametocytes to erythroblasts. To test this hypothesis, I have evaluated the adhesion of gametocytes of several clones expressing different STEVOR proteins known for their adhesive properties at asexual stages. I have also generated and characterized a transgenic line that overexpresses a STEVOR protein known to bind to the GPC in asexual stages. However, no significant adhesion of these erythrocytes infected by gametocytes to erythroblasts could be observed. We have concluded that the sequestration of immature gametocytes in bone marrow is probably not due to erythroblast adhesion. I therefore focused on the second part of the project and I have developed a protocol for infecting human primary erythroblasts with P. falciparum. We have characterized gametocyte development in erythroid precursors by fluorescent microscopy and by electron microscopy: gametocytes in erythroblasts present typical sexual structures and export proteins in the host cell. Furthermore, I have shown that only late stages erythroblasts support the development of gametocytes. Surprisingly, gametocytes are able to complete their development in nucleated cells, resulting in the presence of mature gametocytes in reticulocytes, whereas the differentiation of late erythroblasts is usually much shorter than that of gametocytes. We therefore addressed the hypothesis that the parasite could delay the differentiation of its erythroblast host to complete its development within a nucleated cell. I confirmed this hypothesis by using a flow cytometry approach. One of the parasitic factor responsible for this delay in erythropoiesis differentiation seems to be extracellular vesicles (EV) secreted by the parasite. Indeed, after purification by ultracentrifugation, adding of EV on erythroblasts culture promotes a differentiation delay. This study supports the hypothesis that immature gametocytes could sequester in the bone marrow parenchyma by infecting late stage erythroblast and delaying their conversion into reticulocyte by secreting EV. Once mature, gametocytes inside reticulocytes could reach the blood circulation to be available for the transmission to mosquito