Do desenvolvimento embrionário à tumorigenese: Dissecando o papel biológico e clinico do brachyury, um factor de transcrição da familia T-box

Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeBrachyury, the founding member of the T-box family of transcription factors, is essential for embryo development and has recently emerged as an important player in the oncogenic process. During embryo gastrulation, Brachyury is a specific marker of mesoderm formation and is required for the proper development of the primitive streak, allantois, axial elongation and its homozygous deletion is lethal. Brachyury role in the cancer biology field is recent and limited. Duplication of the Brachyury gene has been associated with the rare bone cancer, chordoma. Brachyury aberrant expression has been demonstrated in epithelial cancer, such as lung and colorectal cancer, and is implicated in several oncogenic processes, such as metastasis formation and adjuvant therapy resistance. Nevertheless, there is limited information about Brachyury role and potential clinical impact in a vast number of solid tumors. Particularly, there is no description of Brachyury in prostate cancer (PCa - epithelial tumor), gastrointestinal stromal tumors (GIST – mesodermal tumor) and in gliomas (neuro-ectodermal tumor). More importantly, little is known about the molecular basis for its role and molecular mechanisms in oncogenesis due to a paucity of information regarding its direct target genes and signaling pathways. In the present thesis we intended to contribute to the body of knowledge of Brachyury role in several solid tumors, by exploring its biological mechanisms and clinical impact. Additionally, we aimed to investigate the potential role of Brachyury in normal neuro-ectodermal tissues, specifically during brain development. We envision the existence of parallelisms in Brachyury regulatory mechanisms and biological roles in the embryo and cancer, which we wish to further explore. In PCa, we found that Brachyury acts as an oncogene and its overexpression was associated with tumor aggressiveness and therapy resistance. Brachyury is associated with several mechanism of therapy resistance, namely epithelial-to-mesenchymal transition, stemness, neuroendocrine transdifferentiation, ERG, Bcl-2 and androgen receptor (AR) expression as well as PTEN loss. Importantly, we showed that Brachyury binds to AR promoter regulating its expression. Due to Brachyury role in mesoderm specification, we analysed its oncogenic role in GISTs, a tumor of mesodermal origin. In agreement with its expression during mesoderm development, Brachyury is overexpressed in GIST and is associated with tumor aggressiveness and poor patient survival, acting as an oncogene. Conversely, Brachyury downregulation in gliomas was associated with poor patient outcome, higher aggressive phenotype and chemotherapy resistance. Brachyury reexpression (by ectopic overexpression or by retinoic acid-mediated induction) was able to decrease glioma tumoriginicity with concomitant tumor differentiation. Moreover, its expression is sufficient to promote a chemo-sensitive phenotype in non-responsive glioma cells by making them prone to respond to cell death stimulus. Therefore, in gliomas Brachyury acts as a tumor suppressor gene. Considering Brachyury novel function as a tumor suppressor gene in gliomas, we explored the role of Brachyury in normal brain development, never before assessed. We showed that Brachyury expression in the developing brain is phylogenetically conserved in chicken, mouse and human, and that its expression persists during adulthood. Importantly, we found that Brachyury plays an unexpected functional role in neuronal differentiation, whereas in mesodermal-derived tissues its expression correlates with an undifferentiated status. These results place Brachyury as a new regulator of neuronal differentiation and refute the long-held dogma of Brachyury as an exclusive mesodermal marker. Summing up, we found that Brachyury has a clinical and functional role in tumorigenesis and may be used as a biomarker for patient prognosis. We provide evidence that it can be an attractive therapeutic target in PCa and GISTs (by its inhibition - anti- Brachyury vaccine GI-6301), as well as in gliomas (by its re-expression via retinoic acid). Additionally, we provide the first description of Brachyury expression during neuronal development in multiple species, highlighting its distinct functional roles in neuronal and mesodermal tissues. Altogether, this work highlights the dual role of oncogene and tumor suppressor gene of Brachyury in human tumors, and significantly adds to our understanding on how Brachyury may contribute to embryo and cancer development.Brachyury, o membro fundador da família de factores de transcrição T-box, é essencial para o desenvolvimento embrionário e foi recentemente implicado no processo oncogénico. Durante o processo de gastrulação embrionário, Brachyury é considerado um marcador específico da mesoderme e é essencial para o desenvolvimento adequado da linha primitiva, alantóide e elongamento axial, sendo letal a ausência de ambos os alelos. O estudo de Brachyury no campo da oncobiologia é bastante recente e limitado. A duplicação deste gene está associada a um tipo tumoral ósseo raro, denominado de cordoma. A sua expressão anómala foi demonstrada em tumores de origem epitelial, nomeadamente, cancro do pulmão e colorectal, tendo sido associado com a progressão tumoral, desenvolvimento de metástases e resistência à quimioterapia. Contudo, a sua informação acerca da função e impacto clínico em tumores sólidos permanece escassa. Em particular, não existe qualquer descrição de Brachyury em cancro da próstata (tumor de origem epitelial), em tumores gastrointestinais (GISTs - tumor de origem mesodérmica) e em gliomas (tumor de origem neuro-ectodérmica). Além disso, pouco se sabe acerca das bases moleculares implicadas na oncogénese devido à falta de conhecimento acerca dos seus genes-alvo e vias de sinalização. O trabalho desenvolvido nesta dissertação pretendeu aumentar o campo de conhecimento sobre o impacto clínico e potenciais mecanismos pelos quais Brachyury participa no processo oncogénico em tumores sólidos. O papel de Brachyury em tecidos neuro-ectodérmicos normais foi também alvo de estudo, em particular durante o desenvolvimento cerebral. Em cancro da próstata, foi possível constatar que o Brachyury actua como um oncogene e a sua sobre-expressão foi associada a um aumento da agressividade tumoral e resistência à terapia. Este factor de transcrição regula vários mecanismos associados à resistência à terapia, nomeadamente, a transição epetilialmesenquimal, aumento de propriedades estaminais, transdiferenciação neuroendócrina e expressão de ERG, Bcl-2 e receptores de androgénio, assim como perda de expressão de PTEN. De salientar que Brachyury liga-se ao promotor do gene de receptor de androgénio regulando directamente a sua expressão. O papel de Brachyury também foi avaliado em tumores de origem mesodérmica – GIST. De acordo com a sua expressão no desenvolvimento mesodérmico, Brachyury mostrou-se sobre-expresso em GIST tendo a sua expressão associada com o pior prognóstico dos pacientes, atuando como um oncogene. Por outro lado, a diminuição de expressão de Brachyury em gliomas foi associada a um pior prognóstico, maior agressividade e resistência à quimioterapia.Quando Brachyury é re-expresso (por sobre-expressão ectópica ou por indução mediada por acido retinóico) foi possível verificar uma diminuição da tumorigenicidade, associada a um aumento da diferenciação tumoral em gliomas. A expressão de Brachyury foi suficiente para promover o fenótipo de quimio-sensibilidade em células gliais resistentes à quimioterapia, através de uma alteração da susceptibilidade a estímulos de morte celular. Tendo em consideração a nova função de Brachyury como um supressor tumoral em gliomas, o estudo foi estendido de forma a explorar o seu papel no desenvolvimento normal do cérebro. Foi possível observar que Brachyury é expresso no cérebro desde o desenvolvimento embrionário até à vida adulta e que isto é filogeneticamente conservado na galinha, ratinho e Humano. É importante salientar que o Brachyury desempenha um papel preponderante na diferenciação neuronal, mas em tecidos que derivam da mesoderme a sua expressão correlaciona-se com um estado de indiferenciação celular. Estes resultados permitem expôr o Brachyury como um novo regulador da diferenciação neuronal, refutando o dogma do Brachyury ser um marcador específico e exclusivo da mesoderme. Em sumário, esta dissertação mostrou que o Brachyury tem um papel clínico e funcional na tumorigénese e poderá ser usado como biomarcador de prognóstico de doentes com cancro. Poderá também ser usado como alvo terapêutico em cancro da próstata e em GISTs (através da sua inibição – vacina anti-Brachyury GI-6301), assim como em gliomas (através da sua re-expressão por ácido retinóico). Além disso, demonstrámos pela primeira vez a expressão de Brachyury durante o desenvolvimento neuronal em diversos modelos animais, evidenciando o seu papel antagónico em tecidos neuronais e mesodérmicos. Em conclusão, este estudo salienta a dupla função do Brachyury em condições normais e malignas (sendo especifico do órgão/tecido e tipo celular) adicionando um novo nível de conhecimento em como Brachyury pode contribuir para o desenvolvimento normal e no contexto oncológico.A tese de doutoramento aqui apresentada foi desenvolvida no âmbito de financiamento pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) através de uma bolsa individual de doutoramento, com a referência SFRH/BD/81369/2011 (no âmbito do QREN – POPH – Tipologia 4.1 – Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu e por fundos nacionais do MCTES). Parte do trabalho aqui desenvolvido foi co-financiado pela FCT (Projecto PTDC/SAU-TOX/114549/2009 and PTDC/SAUBID/121459/2010)