Biotechnological approaches of crude glycerol use: optimization of citric acid production by Yarrowia lipolytica

Thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Ph.D. in Chemical and Biological EngineeringThe increase of biodiesel production results in an accumulation of crude glycerol, the main byproduct from biodiesel industry. To take advantage of the glycerol surplus, many biotechnological processes are being studied. Crude glycerol can be used as carbon source to produce citric acid by Yarrowia lipolytica under nitrogen-limited growth conditions. However, other operational and medium conditions directly affect citric acid production. Yield of citric acid depends upon the concurrent production of other organic acids, for instance isocitric acid, which is strongly dependent of the strain used. Although there are some works described in the literature, several factors still need to be completely understood and optimized in the production of citric acid using crude glycerol. To start with, an experimental design, based on Taguchi method was applied to optimize the culture conditions and to evaluate the effect of pH, carbon/nitrogen (C/N) ratio in the medium, oxygen mass transfer rate (OTR) and salts concentration on citric acid production from pure glycerol by two different Y. lipolytica strains (W29 (ATCC 20460) and CBS 2073). OTR and pH were the factors, which had more effect on citric acid production. Moreover, a significant interaction between the factors OTR and salts was observed. The optimal conditions were also validated with crude glycerol and the citric acid production was similar for both strains using this low cost substrate. Since, as shown by the Taguchi approach, a high OTR was crucial for citric acid production, it seemed appropriate to further study this matter. Therefore a model describing oxygen volumetric mass transfer coefficient ( kL a), in a lab-scale stirred tank bioreactor (STR), as a function of operating conditions (stirring and aeration rates) and cellular density in the citric acid bioprocess, was developed. An empirical correlation was established that fit well in a wide range of operating conditions. As a result, it was found that raising kL a from 7 h-1 to 55 h-1 the citric acid concentration increased. On the other hand, the increase of dissolved oxygen concentration (DO) up to 60 % using controlled DO, led to an increase of citric acid concentration, reaching identical concentration as obtained at kL a of 55 h-1. This work demonstrated that kL a is an adequate parameter for the optimization and scale-up of citric acid production from crude glycerol by Y. lipolytica W29. Taking into account that oxygen is a crucial parameter in citric acid production by Y. lipolytica W29 from crude glycerol, a pressurized and an airlift bioreactor, both reactors associated to high mass transfer efficiency, were used for batch cultures. Increasing air pressure from 1 bar to 2 bar led to an improvement of 40 % in citric acid concentration, whereas in the airlift bioreactor, with an increase from 1 vvm to 1.5 vvm of the aeration rate a 30 % enhancement was attained. Both bioreactor types can be used as alternative ways of improving OTR for citric acid production, leading to important operating costs savings due to less power input. The simultaneous production of isocitric acid is the major problem of using Y. lipolytica strains as citric acid producer. In order to isolate improved strains with reduced isocitric/citric acid ratio and/or enhanced citric acid production, Y. lipolytica W29 was treated with ultraviolet (UV)-irradiation and/or ethyl methane sulfonate (EMS). A 76% and 2.2- fold higher concentration yield of citric acid, was obtained with a mutant strain, Y. lipolytica UV/EMS-10, isolated after the combined treatment with UV-irradiation and EMS.O crescimento na produção de biodiesel tem produzido um aumento da quantidade de glicerol bruto disponível, o principal subproduto da indústria do biodiesel. Vários processos biotecnológicos têm sido estudados como alternativas para poder escoar a quantidade de glicerol bruto disponível. O glicerol bruto pode ser utilizado como fonte de carbono na produção de ácido cítrico pela levedura Yarrowia lipolytica em condições de crescimento com quantidade limitante de azoto. No entanto, outras condições operacionais, o meio de cultura e a estirpe utilizada podem influenciar o perfil de produção de ácido cítrico. Para maximizar a produção de ácido cítrico é muito importante otimizar todos os factores que possam influenciar a sua produção e também entender como esses factores podem afectar o perfil de produção. Inicialmente, foi utilizado um desenho experimental, baseado no método de Taguchi, para otimizar as condições de cultura e avaliar o efeito dos fatores pH, razão carbono/azoto (C/N), taxa de transferência de oxigénio (OTR) e a concentração de sais, na produção de ácido cítrico por duas estirpes diferentes de Y. lipolytica (W29 (ATCC 20460) e CBS 2073) a partir de glicerol puro. Os fatores OTR e pH foram os que mais influenciaram a produção de ácido cítrico. No entanto observou-se um importante efeito de interação entre fatores, principalmente entre OTR e a concentração de sais. As condições ótimas foram também validadas usando glicerol bruto, sendo a produção de ácido cítrico semelhante para ambas as estirpes estudadas. Uma vez que, através do método Taguchi, ficou comprovada a importância crucial da oxigenação, foi decidido aprofundar esta matéria, tendo-se desenvolvido uma correlação empírica explicativa da relação entre o coeficiente volumétrico de transferência de massa de oxigénio ( kL a) num biorreactor de tanque agitado (STR), em função das condições de operação (agitação e taxa de arejamento) e da densidade celular. O aumento do kL a até 55 h-1 resultou num aumento na concentração de ácido cítrico. Por outro lado, utilizando oxigénio dissolvido (DO) constante, o aumento de DO até 60 % de saturação levou a um aumento da concentração de ácido cítrico, tendo-se obtido uma concentração semelhante à conseguida para o kL a de 55 h-1. Neste trabalho demonstra-se que o kL a é um fator adequado de otimização e a ter em conta no aumento de escala da produção de ácido cítrico. Considerando que o oxigénio dissolvido é um parâmetro crucial na produção de ácido cítrico pela Y. lipolytica W29 a partir de glicerol bruto foram utilizados dois bioreatores normalmente associados a elevada eficiência de OTR, um bioreator pressurizado e um airlift. Um aumento da pressão total de ar até 2 bar melhorou em 40 % a concentração e rendimento em ácido cítrico, enquanto que, no biorreator do tipo airlift, um aumento na taxa de arejamento até 1,5 vvm resultou numa melhoria de 30 % para ambos os parâmetros. Ou seja, ambos os biorreatores podem ser usados como alternativa para aumentar OTR na produção de ácido cítrico, levando a importantes poupanças nos custos de operação. A produção simultânea de ácido isocítrico é o principal problema quando se utiliza estirpes de Y. lipolytica na produção de ácido cítrico. Assim, numa tentativa de obter estirpes que apresentem um menor rácio ácido isocítrico/cítrico e/ou uma melhor produção de ácido cítrico, a estirpe Y. lipolytica W29 foi sujeita a uma exposição a irradiação ultra violeta (UV) e/ou um mutagénico químico, metano sulfonato de etilo (EMS). Após o tratamento que combinou a irradiação UV com a exposição a EMS, isolou-se a estirpe mutante Y. lipolytica UV/EMS-10, que apresentou um aumento de 76 % na concentração de ácido cítrico e um rendimento em ácido cítrico 2,2 vezes maior em comparação com a estirpe parental.À instituição de acolhimento CEB- Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho pelo acolhimento e por me ter proporcionado todas as condições para realizar este trabalho científico. Ao Projeto “BioInd – Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and Agro- Food processes", REF. NORTE-07-0124-FEDER- 000028, cofinanciado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), ao abrigo do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), ao Projecto RECI/BBBEBI/ 0179/2012 (FCOMP-01-0124-FEDER-027462), e à Fundação para a Ciência e Tecnologia pela atribuição da bolsa de doutoramento (SFRH/BD/72621/2010)