Insights into bacterial colony morphology evolution and diversification during infection development in cystic fibrosis

Tese de Doutoramento em Engenharia Biomédica.Pseudomonas aeruginosa infections are the major cause of high morbidity and mortaiity in cystic fibrosis (CF) patients. Despite the long and aggressive antibiotic treatments, P. aeruginosa still persists causing chronic infections. Its Iong-persistence is due to sophisticated mechanisms of adaptation, including cional diversification into specialized CF-adapted phenotypes. While CF community awaits the development of effective therapies targeting conductance regulator mutations, the gold standard of CF disease management is the eradication of P. aeruginosa from CF lungs as soon as detected. Early eradication of P. aeruginosa avoids or, at ieast, retards the development of chronic infections preserving lung function. But to achieve a successful eradication, it is need understanding the eariy adaptations mechanisms used by P. aeruginosa for antimicrobial agents target them. Up to now these mechanisms are unclear. Being so, this project aimed to determine the early adaptations undergone by P. aeruginosa after CF lungs colonization and their driven forces in several clinical scenarios. Alterations in colony morphology are one of the indicators of cional diversification of bacteria in CF iungs and are also associated with different virulence factors expression and antibiotic resistance. Therefore, it was take the advantage of this macroscopic feature of P. aeruginosa to monitor its evolution in CF environment after in vitro initial colonization. Despite its potential, colony morphology characterisation method exhibit has some restrictions, such as the unclear impact of the experimental parameters in colony morphogenesis and detection of colony diversity, variability of vocabulary and inconsistent concepts about morphoiogical traits and the time to return results. Therefore, before analysing P. aeruginosa clonal diversification in CF environment, it was attempted to introduce some improvements on this method related to standardisation of the experimental parameters and vocabulary and speed up colony analysis in three different studies. The results of the first study demonstrated that ali experimental parameters anaiysed, including colony growth time, colony density per plate, culture media, bacterial mode of growth and bacterial genetic background influenced colony morphogenesis and the detection of bacterial diversity. Therefore, a set of guidelines was created and proposed to clinical community in order to standardise the experimental parameters. Further, a morphological classification system to unambiguously characterise and describe bacterial colonies was constructed based on literature. The system was deeply tested and demonstrated to be accurate for bacterial colonies characterisation. The third study, it was aimed to introduce some quickness and highthroughput features to coiony morpholog' characterisation verifying whether MALDI-TOF MS could distinguished morphotypes. MALDI-TOF MS colony classification did not totaily match with manual colony characterisation, leading to conclude that MALDI-TOF MS provided additional information about colony variants not visible at naked eye. MALDI-TOF MS cannot thus "replace" colony morphology method but rather complement it. The data obtained in the first study demonstrated that colony morphology characterisation could be used as a reliable method to detect biofilm-derived colony morphotypes. So, it was tried to find out a colony morphology variant characteristic of biofllm lifestyle, which' could be used as a marker of P. aeruginosa bioflim growth and the development of chronic infections. Thrèsults revealed that bioflim population diversity was highly strain-dependent, hindering the unambiguous establishrrent of a coiony variant marker of P. aeruginosa biof'ilms. Nonetheless, small colony variants (SCV) demonstrated to be a strong hint of bioflim growth. In order to investigate the early adaptations undergone by P. aeruginosa after CF Iungs colonisation, bacteria grow in artificial sputum medium during ten days in the presence and absence of ciprofloxacin, an antibiotic often used in CF context. Data revealed that substantial phenotypic diversity is likely to be present in P. aeruginosa populations shortly after CF lungs colonization. Ciprofloxacin concentrations at this simulated early stage of disease demonstrated to play dose-dependent role. lnhibitory concentrations of ciprofloxacin, established based on the MIC of biofllm celI, were effective in bacterial eradication, in contrast to the sub-inhibitory doses that triggered P. aeruginosa diversification into new "fitter" variants. lmpaired swimming motility was one of the first signs of adaptation noticed in ali P. aeruginosa clonal variants, either in the presence or absence of ciprofloxacin. It was speculated that this adaptation was triggered by the environmental CF conditions due to the absence of mutators. Being so, impaired swimming motility was considered a potential disease marker for early P. aeruginosa adaptation and infection development. It was also found that some coiony morphology traits, including sheath, size and colour, could be useful indicators of antimicrobial resistance towards some antibiotics and of some virulence factors expression. During the development of this project the comparison of morphological traits and phenotypic data among colony morphotypes was a hard task. So, to easily perform this kind of analyses it was created a new ontology-based tool for the description of colony morphologies formed by bacteria, called MorphoCol. MorphoCoi establishes and standardises in consistent way the minimum information necessary to describe colony morphotypes and also the phenotypic data related to the colony-forming bacteria. In near future, this knowledgebase will transform the findings of this project and upcoming results related to colony morphology variation into valuable information for clinical decision making. The overali data will have great impact on CF disease management because relevant improvements were introduced in the colony morphology characterisation method that will strengthen clinical diagnosis. Clonai diversification in CF lungs and other host sites could be now better monitored and accurately described. Moreover, the identification of a putative CF disease marker of eariy P. aeruginosa adaptation and infection development will also assist in the design of tailored effective antimicrobial therapies.Pseudomonas aeruginosa é a maior causa das elevadas taxas de morbidez e mortalidade associada a pacientes com fibrose cística (FC). Apesar dos longos e agressivos tratamentos com antibióticos, a P. aeruginosa persiste originando infecções crónicas. A sua longa persistência deve-se a sofisticados mecanismos de adaptação, designadamente a diversificação clonal em fenótipos altamente adaptados às condições de FC. Enquanto a comunidade médica aguarda pelo desenvolvimento de terapias eficazes direcionadas ao regulador mutacional de condutância, o standard terapêutico seguido é a erradicação da P. aeruginosa logo que detetada. A erradicação atempada da P. aeruginosa evita ou, pelo menos retarda, o desenvolvimento de infecções crónicas, preservando assim a função respiratória. Contudo, para obter a erradicação bacteriana é necessário perceber os mecanismos iniciais de adaptação da P. aeruginosa para que os agentes antimicrobianos os possam bloquear. Assim sendo, este projeto pretendeu determinar quais as adaptações iniciais da P. aeruginosa após colonização das vias respiratórias de pacientes com FC e as suas respetivas forças impulsionadoras para diversas situações clínicas. As alterações na morfologia de colónia é um dos indicadores de diversificação clonal das bactérias em ambiente de FC. Estas alterações estão igualmente associadas à expressão diferencial de factores de virulência e à resistência a antibióticos. Assim, utilizou-se esta característica macroscópica da P. aeruginosa para monitorizar a sua evolução e adaptação em ambiente FC. Apesar do seu potencial, a caracterização de morfologia de colónias apresenta algumas restrições, tais como o impacto incerto dos parâmetros experimentais na morfogénese das colónias e na detecção de diversidade de colónias, a variabilidade de vocabulário e conceitos inconsistentes sobre os traços morfológicos, e o tempo de obtenção de resultados. Assim, antes da análise da diversidade clonal da P. aeruginosa em ambiente FC, tentou-se introduzir alguns melhoramentos neste método em três diferentes estudos, nomeadamente na estandardização dos parâmetros experimentais e vocabulário, bem como acelerar a obtenção de resultados. Os resultados do primeiro estudo demonstraram que todos os parâmetros experimentais analisados (tempo de crescimento das colónias, densidade de colónias por placa de cultura, meio de cultura, modo de crescimento bacteriano e os antecedentes genéticos) influenciaram a morfogénese das colónias e na detecção de diversidade bacteriana. Assim sendo, foi elaborado e proposto um conjunto de linhas de orientação para estandardização dos parâmetros experimentais. Posteriormente, foi construído um sistema de classificação para inequivocamente caracterizar a morfologia de colónias com base na literatura. Este sistema foi amplamente testado e demonstrou-se adequado para a caracterização de colónias bacterianas. No terceiro estudo tentou-se introduzir alguma celeridade e aumento do débito de resultados verificando se MALDI-TOF MS seria capaz de distinguir os moríótipos. Esta técnica forneceu uma classificação dos morfótipos ligeiramente diferente comparativamente à classificação manual. Tal, leva a concluir que MALDI-TOF MS fornece informação adicional sobre os morfótipos que não foi observável macroscopicamente. Assim, o MALDITOF MS não pode assim substituir" o método de caracterização manual de morfologia de colónias mas pode ser um método complementar. Os dados obtidos com o primeiro estudo demonstraram que a caracterização de morfologia de colónias pode ser usado na detecção de morfótipos derivados de biofilmes. Assim, tentou-se identificar um variante morfológico característico do crescimento em biofilmes que possa ser posteriormente usado para detectar este modo de crescimento e, consequentemente o desenvolvimento de infecções crónicas. Os resultados revelaram que diversidade população dos biofilmes foi dependente da estirpe, dificultando assim a identificação do variante morfológico característico de biofilme. Ainda assim, verificou-se que as small colony vanants (SCV) são um forte indicador do crescimento séssil. De forma a investigar as adaptações iniciais da P. aeruginosa após colonização de vias respiratórias com FC, as bactérias foram crescidas em muco artificial (MA) na presença e ausência de ciprofloxacina durante 10 dias. Os resultados deste estudo revelaram que é provável a existência de diversidade fenotípica logo após a colonização das vias respiratórias. As diferentes concentrações de ciprofloxacina testadas demonstraram desempenhar uma ação dose-dependente. Concentrações inibitórias, estabelecidas com base na MIC de células de biofilme, foram eficazes na erradicação da P. aeruginosa em MA, contrariamente às concentrações sub-inibitórias. Estas concentrações "acionaram" a diversificação fenotípica em variantes melhor adaptados ao ambiente FC. A limitada capacidade de swimming foi um dos sinais de adaptação inicial da P. aeruginosa verificada em todos os variantes fenótipicos. Foi assim especulado que esta adaptação foi promovida pelas condições típicas de FC devido à ausência de mutators. Como tal, a capacidade limitada de swimming foi considerada um potencial marcador dos estágios iniciais do desenvolvimento de infecções em FC. Foi igualmente verificado que alguns traço morfológicos de colónias, nomeadamente a bainha, tamanho e cor, foram indicadores de alterações na expressão de fatores de virulência e resistência a antibióticos. Durante o desenvolvimento deste projeto a comparação de traços morfológicos das colónias, bem como de dados fenótipos foi uma tarefa árdua. Neste sentido, foi desenvolvida uma base de dados, designada por MorphoCol, para a descrição de morfologia de colónias formadas por bactérias. MorphoCol estabelece e uniformiza a informação mínima necessária de uma forma estruturada e consistente. Num futuro próximo, esta base de dados transformará os resultados deste projeto e outros subsequentes em informação relevante para a tomada de decisão clínica. O conjunto de resultados obtidos neste projeto terá um impacto considerável na gestão clínica da FC devido aos consideráveis melhoramentos introduzidos no método de caracterização de colónias pois fortalecerão o diagnóstico clínico. A diversificação clonal nas vias respiratórias de FC e nos outros locais pode ser assim melhor monitorizada e descrita adequadamente. Para além disso, a identificação de possíveis marcadores para estágios iniciais de adaptação de P. aeruginosa em FC ajudarão na definição de terapias antimicrobianas eficazes