Study of probiotic strains as silage inoculants to counteract the mycotoxin problem

Dissertação de mestrado em BioengenhariaA deterioração de alimentos por fungos com a consequente produção de micotoxinas é um problema que tem importantes implicações económicas e na saúde. Estima-se que 5 a 10% da produção mundial de alimentos é perdida devido a contaminação por fungos. Os fungos micotoxigénicos como Aspergillus, Fusarium e Penicillium sintetizam micotoxinas, tais como, aflatoxinas (AFLs) e ocratoxina A (OTA). A bioconservação, definida como o controlo de um organismo por outro, tem recebido muita atenção nos últimos anos. Neste campo, as bactérias do ácido lático (BAL) são de grande interesse, uma vez que têm amplas propriedades probióticas e têm sido tradicionalmente utilizadas em processos de fermentação. Os objetivos deste trabalho foram: (i) selecionar BAL com propriedades antifúngicas e avaliar o seu efeito inibidor na síntese de micotoxinas; (ii) avaliar o efeito das BAL em micro-silagens contaminadas artificialmente com OTA e fungos micotoxigénicos. Numa primeira abordagem, o método de camada dupla foi utilizado para selecionar BAL capazes de inibir o crescimento de A. flavus, A. carbonarius e A. parasiticus. De seguida, os sobrenadantes estéreis das estirpes mais ativas (L. casei UM-55 e L. plantarum UM-7) foram testados em A. flavus utilizando o método de envenenamento. Neste caso, vários parâmetros foram estudados: tratamento do sobrenadante com calor, protéases e NaOH (neutralização de pH); tempo de incubação; e concentração de sobrenadante adicionado ao meio de cultura. Adicionalmente, verificou-se o seu efeito noutras espécies aflatoxigénicas. O crescimento fúngico e a concentração de aflatoxinas produzidas em cada ensaio foram determinadas e comparadas com controlos. Realizaram-se ainda micro-silagens contaminadas com OTA, A. flavus ou A. carbonarius que foram inoculadas com as BAL UM-55, UM-7 e UTAD-473. Avaliou-se o desenvolvimento das BAL, dos fungos micotoxigénicos e a produção de AFLs e OTA, bem como alguns parâmetros para determinar a qualidade dessas silagens. Os sobrenadantes de L. casei UM-55 e L. plantarum UM-7 foram identificados como os mais ativos. O crescimento de A. flavus após 7 dias a 25 °C foi reduzido em cerca de 31 e 25%, respetivamente. A produção de AFLs foram inibidas em cerca de 91 e 80%, respetivamente. Estas percentagens de inibição diminuíram ligeiramente ao fim de 24 dias, tendo-se reduzido para 13% no crescimento e 70% na produção de AFLs, com ambas as estirpes. O crescimento do fungo e a produção de AFLs também diminuíram com o aumento da quantidade de sobrenadante adicionada ao meio de cultura. As BAL L. casei UM-55 e L. plantarum UM-7 tiveram um efeito inibidor maior sobre A. flavus e A. parasiticus, respetivamente. Outras espécies produtoras de aflatoxinas foram menos inibidas. Relativamente às silagens, as BAL utilizadas não produziram qualquer efeito no crescimento fúngico nem nas micotoxinas.The deterioration of food due to fungal growth and the subsequent production of mycotoxins have a significant economic impact and pose serious health problems. It is estimated that 5 to 10% of the world's food production is lost due to fungal contamination. Micotoxigenic fungi such as Aspergillus, Fusarium and Penicillium synthesize mycotoxins such as aflatoxins (AFLs) and ochratoxin A (OTA). Biopreservation, defined as the control of an organism by another, has been receiving considerable attention in recent years. In this field, lactic acid bacteria (LAB) can be used as natural biopreservatives, since they have probiotic properties and have been used traditionally in fermentation processes. The objectives of this study were: (i) select LAB with antifungal properties and evaluate their inhibitory effect on the synthesis of mycotoxins, (ii) evaluate the effect of LAB in micro-silages artificially contaminated with OTA or micotoxigenic fungi. In a first approach, the double layer method was used to select LAB strains capable of inhibiting the growth of A. flavus, A. carbonarius and A. parasiticus. Following, sterile supernatants of most active strains (L. casei UM-55 and L. plantarum UM-7) were tested in A. flavus using the food poisoning method. In this case, several parameters were assessed: treatment of supernatants with heat, proteases and NaOH (pH neutralization); incubation time; and concentration of supernatant added to culture medium. The supernatants effect on other aflatoxigenic species was also evaluated. The fungal growth and produced AFLs in each experiment were determined and compared with controls. In addition, experiments of micro-silages contaminated with OTA, A. flavus or A. carbonarius, and inoculated with LAB UM-55, UM-7 and UTAD-473 were performed. Over the ensilage period, it was evaluated the development of LAB, micotoxigenic fungi and the production of AFLs and OTA. Some quality parameters of silage were also determined. The supernatants of L. casei UM-55 and L. plantarum UM-7 were identified as the most active. The growth of A. flavus after 7 days at 25 °C was reduced by about 31 and 25%, respectively. AFLs production were also inhibited by about 91 and 80%, respectively. These percentages of inhibition declined slightly after 24 days, reducing to 13% for fungal growth and to 70% for AFLs production, with both strains. Fungal growth and AFLs production were also reduced with increasing amounts of supernatant added to cultures media. Strains L. casei UM-55 and L. plantarum UM-7 had a stronger inhibitory effect on A. flavus and A. parasiticus, respectively. Other aflatoxigenic species were less inhibited. In the silages, LAB used had no effect on fungal growth or on the mycotoxins