Hydrocarbonoclastic bacteria: from bioremediation to bioenergy feedstock

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica.Bacterial storage lipids are being considered as viable alternative feedstocks for industrial and biotechnological applications, compared to conventional ones. The production of these bacterial compounds can be obtained from different carbon sources, including inexpensive and recalcitrant wastes. This thesis explores the potential of using hydrocarbonoclastic bacteria to obtain lipid reserve substances from hydrocarbon-based wastes, promoting a more economic and environmentally sustainable biotechnological process combining pollution reduction and production of added value compounds. The production of storage lipids by a hydrocarbon degrading bacterium, Rhodococcus opacus B4, from glucose, acetate and hexadecane, was reported for the first time and compared to Rhodococcus opacus PD630, the best known triacylglycerols (TAG) accumulating bacterium. TAG was the main storage compound produced by both strains. R. opacus B4 presented 2 to 3 fold higher TAG volumetric productions than R. opacus PD630 when cultivated in hexadecane. Subsequently, the ability of R. opacus B4 to decontaminate hexadecane-contaminated cork sorbents while producing lipid storage compounds was shown. Two types of cork sorbents, natural and thermally treated cork, were used. R. opacus B4 was able to degrade practically all hexadecane impregnated in both cork sorbents and TAG was the main neutral lipid compound produced. The potential of the obtained lipid-rich biomass for biomethane production was assessed and an efficent conversion to methane was observed. An indigenous microbial community enriched in carbon storage producing hydrocarbon degrading bacteria was developed from a hydrocarbon-based wastewater (containing lubricant and engine oil waste), using feast and famine conditions in the form of alternating periods of presence of the carbon substrate followed by its absence. The most dominant bacteria identified belongs to hydrocarbon degrading Rhodococcus, Acinetobacter and Pseudomonas genera, known for producing mainly triacylglycerols (TAG), wax esters (WE) and polyhydroxyalkanoates (PHA), respectively. The enriched community was able to accumulate small amounts of TAG and PHA, and higher levels of a non-identified lipid as well as to efficiently degrade the wastewater hydrocarbons. The effect of different cultivation parameters on storage compound production by the developed enriched community was evaluated, using central composite circumscribed design based on surface response methodology. The interaction between carbon and nitrogen concentrations positively influenced PHA accumulation whereas interaction between carbon and nitrogen concentrations with cultivation time affected PHA in a negative way. Regarding neutral lipids production, nitrogen concentration and the interaction between carbon and nitrogen concentrations were the significant parameters. Neutral lipids produced were essentially TAG, presenting a highly diversity of chemical structures composed by a narrow range of fatty acids. Finally, a genome-based comparative analysis of genes and metabolic reactions responsible for TAG, WE and polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthesis in members of Rhodococcus, Acinetobacter, Alcanivorax and Pseudomonas genera was performed to get deeper knowledge on carbon storage compounds metabolism in hydrocarbonoclastic bacteria. The presence of genes coding for complete metabolic pathways for TAG and PHB biosynthesis was detected in all species. Rhodococcus strains are highly enriched in genes involved in TAG and PHB metabolism, whereas Alcanivorax, Acinetobacter and Pseudomonas have a high number of genes coding for enzymes involved in PHB production.Os lípidos de reserva bacterianos têm sido considerados como matéria-prima alternativa aos lípidos convencionais para aplicações biotecnológicas e industriais. A produção destes compostos pode ser obtida a partir de diferentes fontes de carbono, incluindo resíduos recalcitrantes e economicamente acessíveis. Esta tese teve como principal objetivo explorar o potencial de bactérias hidrocarbonoclásticas para a produção de lípidos de reserva a partir de resíduos contendo hidrocarbonetos. Esta capacidade pode contribuir para o desenvolvimento de um processo biotecnológico enconomicamente e ambientalmente sustentável, envolvendo a descontaminação biológica de resíduos e a produção de compostos de valor acrescentado. A produção de lipidos de reserva em Rhodococcus opacus B4, uma bactéria degradadora de hidrocarbonetos, a partir de glucose, acetato e hexadecano, foi descrita pela primeira vez e comparada com a bactéria Rhodococcus opacus PD630, considerada como a melhor produtora de triacilgliceróis (TAG). Os triacilgliceróis foram os principais compostos produzidos por ambas as estirpes. R. opacus B4 apresentou uma produção volumétrica de TAG duas a três vezes superior à de R. opacus PD630 quando cultivadas em hexadecano. A capacidade de R. opacus B4 para degradar hexadecano adorvido a cortiça e produzir lípidos de reserva foi avaliada. Foram utilizados dois tipos de adsorventes de cortiça, cortiça natural e cortiça termicamente tratada. R. opacus B4 degradou eficazmente o hexadecano impregnado em ambas as cortiças e os triacilgliceróis foram os principais lípidos de reserva produzidos. O potencial de produção de metano a partir da biomassa rica em lípidos obtida foi analisado, tendo-se observado uma eficiente conversão a metano. O desenvolvimento de uma comunidade microbiana enriquecida em bactérias hidrocarbonoclásticas produtoras de compostos de reserva foi obtido a partir de águas residuais contendo lubrificantes e óleo de motor, aplicando períodos alternados de presença e ausência de fonte de carbono. As bactérias mais dominantes identificadas pertencem a géneros hidrocarbonoclásticos, nomeadamente Rhodococcus, Acinetobacter e Pseudomonas, conhecidas como produtoras de TAG, ésteres de cera (WE) e polihidroxialcanoatos (PHA), respetivamente. A comunidade enriquecida acumulou baixas quantidades de TAG e PHA e quantidades superiores de um lípido desconhecido, tendo degradado eficientemente os hidrocarbonetos presentes na água residual. O efeito de diferentes parâmetros de cultivo na produção de compostos de reserva pela comunidade enriquecida foi avaliado através de um desenho fatorial de experiências baseado na metodologia de superfície de resposta (RSM). A interação entre as concentrações de carbono e azoto influenciou positivamente a acumulação de PHA enquanto que as interações entre o período de cultivo e as concentrações de carbono e azoto e o tempo de cultivo afetaram negativamente a produção de PHA. A produção de lípidos neutros foi significativamente influenciada pela concentração de azoto e pela interação entre as concentrações de carbono e azoto. Os lípidos neutros produzidos foram essencialmente TAG, apresentando uma elevada diversidade de estruturas químicas compostas por uma ampla gama de ácidos gordos. Foi efetuada uma análise comparativa de genes e reações metabólicas responsáveis pela síntese de TAG, WE e polihidroxibutiratos (PHB) em espécies pertencentes aos géneros Rhodococcus, Acinetobacter, Alcanivorax e Pseudomonas. A presença de genes que codificam para enzimas pertencentes a todas as vias metabólicas relativas à produção de TAG e PHB foi detetada em todas as espécies estudadas. As estirpes de Rhodococcus opacus apresentam um número elevado de genes envolvidos no metabolismo de TAG e PHB, enquanto que Alcanivorax borkumensis SK2, Acinetobacter baylyi ADP1 e Pseudomonas putida KT2440 possuem uma grande diversidade de genes que codificam para enzimas envolvidas na produção de PHB.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) SFRH/BD/64500/2009.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) Strategic Project of UID/BIO/04469/2013 unit.The project RECI/BBB-EBI/0179/2012 (FCOMP-01-0124-FEDER-027462).The Project BioEnv - Biotechnology and Bioengineering for a sustainable world, ref Norte - 07-0124-FEDER-000048, co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 - O Novo Norte), QREN, FEDER