Análise de RNAseq da resposta à secura de raiz de Quercus suber

Dissertação de mestrado em Plant Molecular Biology, Biotechnology and BioentrepreneurshipCork oak (Quercus suber L.) is a typical species from the Portuguese Mediterranean forest, usually growing in dry environments. Mainly due to its high economic value, cork oak has been considered a protected plant species and a national species of interest. Factors resulting from climate changes, e.g. increased temperature, high light intensity, drought and air pollution are directly affecting the development of plants and reducing their productivity. Next generation sequencing, in particular RNAseq, has proven to be a powerful tool with a diverse range of applications, and provides fundamental insight into the structure and regulatory aspects of gene networks, particularly when organisms without avalible OMICs resources, such as a sequence genome, are studied. To address the cork oak’s response and regulation to water availability, differential transcriptomic analysis was performed in roots of young plantlets subjected to moderate and high drought conditions, comparing to well-irrigated plants. Photosynthetic activity measured by PAM fluorometry and photosynthetic pigment content were used as physiological indicators of plant fitness. cDNA was obtained from previously droughtstressed roots RNA, and sequencing was carried out by Roche’s 454 technology resulting in three libraries, of a 1.8 million reads in total, later assembled into 21012 unigenes, that would be used for mapping steps, in order to identify differential expression. This resulted in the identification of 353 up-regulated and 193 down-regulated genes. Primary in silico analysis identified a significant number of effector genes traditionally associated with drought responses, such as dehydrins, LEA proteins, cell wall remodeling, transcription factors and ubiquiting-associated genes, suggesting a tight control of drought responses at both the transcriptional and protein turnover levels. Further in silico analysis was accomplished by annotating the genes against the genome of the model plant Arabidopsis thaliana, allowing for ortholog identification. This allowed us to establish gene networks based on functional characteristics, such as gene co-expression, protein-protein interactions and co-localization. Coupled with ciselement enrichment and transcription factor identification, this analysis enabled the establishment of functional and regulatory relationships between differentially expressed genes. Ultimately, we demonstrated the induction, in drought stressed Quercus suber roots, of a complete, ABA-dependent signaling cascade. Elements of this signaling cascade range from ABA-sensing components to transcription factors and then to effector genes involved in the drought response.O sobreiro (Quercus suber) é uma especie tipica da floresta Mediterranea Portuguesa e cresce usualmente em ambientes secos. Devido ao seu elevado valor economico, o sobreiro é considerado uma especie vegetal protegida e de interesse nacional. Fatores decorrentes das alterações climaticas como, temperatura e intensidade luminosa elevadas, seca e bem como poluentes afetam o desemvolvimento vegetal, reduzindo a produtividade de cultivares de interesse. A sequenciação de nova geração, em particular RNA-seq, tem se destacando como um poderosa ferramenta de aplicações diversas, providenciando conhecimentos fundamentais sobre aspetos estruturais e reguladores de redes genéticas, particularmente em estudos em organismos sem recursos das OMICas, como um genoma sequenciado. Para estudar a resposta do sobreiro a condições que comprometem a disponiblidade de água, foi efetuada análise diferencial dos transcriptomas de raizes de plantas jovens sujeitas a condições de secura moderada e severa, e os resultados foram comparados com os obtidos a partir de raizes de plantas bem irrigadas. A actividade fotossintética foi medida for flurometria PAM e o conteúdo de prolina e pigmentos fotossinteticos foram considerados como indicadores fisiologicos do fitness das plantas. cDNA, obtido a partir de RNA extraido destas raizes, foi sequenciado por tecnologia 454 da Roche, resultando em 3 bibliotecas de 1.8 milhões de reads total, mais tarde assembladas em 21012 unigenes para serem utilizadas nos passos de mapeamento utilizado em expressão diferencial. Esta analise resutou em 353 genes positivamente indusidos e 193 genes negativamente indusidos. Analise primária in silico identificou um número significativo de genes efetores tradicionalmente associados à resposta a secura, como desidrinas, proteínas LEA, genes de remodelação da parede celular, fatores de transcrição e genes assossiados a ubiquitina, sugerindo um controlo apertado da resposta à secura dos níveis transcricionais, bem como de abundância proteica. Nova análise in silico foi realizada atravez da identificação de genes ortologos, anotando-se os genes de sobreiro contra o genoma de Arabidopsis thaliana. Este estudo possibilitou o estabelecimento de redes genéticas basiadas em características funcionais como co-expressão, interação proteína-proteína e co-localização. Conjuntamente com análise de enriquecimento de elementos cis e identificação de fatores de transcripção, foi possivel establecer relações funcionais e e de regulação entre os genes. Os resultandos permitem sugerir que ocorre indução de uma cascata de sinalização dependente do ABA em raizes de Q. suber em condições de secura, onde estão envolvidos sensores do ABA, fatores de transcrição e genes efectores envolvidos na resposta à secura