Co-encapsulation of siRNA with non-coding pDNA or Poly-L-glutamic acid in DODAB:MO (2:1) liposomes for enhanced gene silencing

Dissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasRNA interference (RNAi) has been found to be an important biological strategy for gene silencing. This pathway can be used as a gene therapy approach by using synthetic short interfering RNA (siRNA) molecules to promote the silencing of undesirable target genes. However, the delivery of nucleic acids into the cells is a very inefficient process due to several extracellular and intracellular barriers. Several physical, chemical and biological strategies have been developed to promote the delivery of nucleic acids into cells. Although viral vectors have been reported to be the most efficient nucleic acid delivery systems, they trigger the immune system and promote high levels of toxicity. Non-viral vectors, though not as efficient as their viral counterparts, appeared as a safer method for therapeutic gene delivery. In this field, cationic liposomes emerged as one of the most promising and widely used non-viral gene carriers. Recent studies from our group have established a novel liposomal formulation for siRNA delivery, based on the cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) and the helper lipid monoolein (MO). This liposome formulation has promoted efficient gene silencing in a human non-small cell lung carcinoma cell line (H1299). In this project, we aimed to improve the silencing efficiency of DODAB:MO (2:1) liposomes, by promoting the co-encapsulation of siRNA with additional anionic components. Poly-L-glutamic acid (PG1 or PG2) or non-coding plasmid DNA (pDNA) were added to siRNA suspension and encapsulated within DODAB:MO (2:1) liposomes. The systems obtained were compared with lipoplexes containing only siRNA. Lipoplexes were characterized in order to understand the differences caused by addition of the anionic components. The results obtained during this project suggest that the addition of either pDNA or PG molecules to siRNA/DODAB:MO lipoplexes results in systems with similar physicochemical properties, namely size and surface charge. Nevertheless, some improvements in the siRNA encapsulation efficiency, cellular internalization and cytotoxicity were obtained when compared to siRNA lipoplexes. Additionally, lipoplexes co-encapsulating siRNA and pDNA or PG have promoted higher EGFP gene silencing efficiency, suggesting that co-encapsulation of siRNA with an additional anionic cargo can improve silencing efficiency of our liposomal formulation.Desde a sua descoberta, o RNA de interferência (RNAi) tornou-se uma estratégia biológica importante para o silenciamento de genes. Esta via pode ser usada como uma abordagem de terapia genética, utilizando short interfering RNA (siRNA) para promover o silenciamento de genes indesejáveis. No entanto, a entrega de siRNA em células é um processo muito ineficiente devido a várias barreiras extracelulares e intracelulares. Várias estratégias físicas, químicas e biológicas têm sido desenvolvidas para promover a transferência de ácidos nucleicos para as células. Vários estudos mostram que, vetores virais são sistemas de entrega eficazes, contudo, desencadeiam resposta imunitária e promovem níveis elevados de toxicidade. Os vetores não virais, embora não tão eficientes como os seus homólogos virais, aparecem como um método mais seguro para a entrega de siRNA. Neste campo, os lipossomas catiónicos tornaram-se num dos vetores não virais mais promissores e amplamente utilizados. Estudos recentes do nosso grupo estabeleceram uma nova formulação lipossomal para a entrega de siRNA, com base no lípido catiónico brometo de dioctadecildimetilamónio (DODAB) e o lípido adjuvante monooleína (MO). Esta formulação de lipossomas foi capaz de promover o silenciamento genético de forma eficiente numa linha celular humana de células não-pequenas de carcinoma pulmonar (H1299). Neste projeto, procuramos melhorar a eficiência de silenciamento de liposomas DODAB:MO (2:1), através da promoção da co-encapsulação de siRNA com componentes aniónicos adicionais. Poli-glutamato (PG1 ou PG2) ou DNA plasmídico não codificante (pDNA) foram adicionados à suspensão de siRNA e encapsulados em liposomas DODAB:MO (2:1), e os sistemas obtidos foram comparados com lipoplexos contendo apenas siRNA. Os lipoplexos foram caracterizados de modo a compreender as diferenças causadas pela adição dos componentes aniónicos. Os resultados obtidos durante este projeto sugerem que a adição de moléculas de pDNA ou PG a lipoplexos compostos por siRNA e lipossomas DODAB:MO (2:1) resulta em sistemas com propriedades físico-químicas semelhantes, mais especificamente, o tamanho (Zaverage) e a carga superficial (ζ-potential). No entanto, foram obtidos algumas melhorias na eficiência de encapsulação de siRNA, internalização celular e citotoxicidade destes sistemas, quando comparado com lipoplexos com apenas siRNA.Além disso, lipoplexos onde o siRNA é co-encapsulado com pDNA ou PG, promoveram maior eficiência de silenciamento do gene EGFP em linhas celulares 293T/GFP-puro, sugerindo que a co-encapsulação de siRNA com uma carga aniónica adicional pode melhorar a eficiência de silenciamento da nossa formulação lipossomal