Important human metabolites of phenolic acids from diet with wild mushrooms: chemical synthesis and studies of their antioxidant, antitumor and antimicrobial properties

Tese de doutoramento em Ciências (ramo de conhecimento em Química)In this study, seven wild mushroom species (Ganoderma lucidum, Coprinopsis atramentaria, Rhodotus palmatus, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Xerocomus chrysenteron and Morchella esculenta), were characterized for their nutritional value (macronutrients and energy) and chemical composition (fatty acids, tocopherols, sugars and organic acids). A special focus was given to the analysis of phenolic acids and related compounds in mushroom fruiting bodies, spores and in vitro produced mycelia, by using chromatographic and mass spectrometry techniques. After mushrooms ingestion, the mentioned compounds suffer conjugation reactions, such as methylation and glucuronidation, and their structure can vary, modifying or not, their bioactive properties. With that aim, circulating metabolites of phenolic acids found in humans, such as methyl and glucuronide derivatives, were prepared by chemical synthesis and further characterized by the usual methods (melting point, 1H and 13C-nuclear magnetic resonance, and high resolution mass spectrometry). The bioactive properties of the synthesized compounds were evaluated and compared with the parent phenolic acid, and also with the mushroom phenolic extract. The bioactivities assessed were: i) antioxidant activity, measured by free radicals scavenging activity, reducing power and lipid peroxidation inhibition in vitro assays; ii) antimicrobial activity, including antibacterial and antifungal properties with evaluation of demelanizing capacity, determined by disc diffusion and microdilution methods; and iii) inhibitory growth activity against different human tumor cell lines, and also against non-tumor porcine liver primary cells culture to evaluate toxicity, using sulforhodamine B assay. The studied edible mushroom species are a good choice to include in our daily diet due to their richness in nutrients such as carbohydrates and proteins, and bioactive molecules, being also low caloric foods due to the low fat and energy contents. Furthermore, mushroom phenolic extracts showed antioxidant and antimicrobial properties, and also the capacity to inhibit the growth of human tumor cell lines. The synthesized methylated and acetyl glucuronated methyl esters derivatives revealed, in general, higher inhibitory growth activity against human tumor cell lines and antimicrobial activity than their parent compounds being, in the latter case, even higher than the one showed by standard antibiotics. Moreover, all the tested compounds revealed no toxicity against non-tumor cells. This means that the inclusion of methyl and acetyl glucuronic methyl ester groups in the molecule can, in some cases, increase the phenolic acids bioactivity. Nevertheless, future studies are needed in order to understand and clarify the specific mechanistic pathways of these important metabolites or metabolite derivatives.Neste trabalho, caracterizaram-se sete espécies de cogumelos silvestres (Ganoderma lucidum, Coprinopsis atramentaria, Rhodotus palmatos, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Xerocomus chrysenteron, e Morchella esculenta) quanto ao seu valor nutricional (macronutrientes e energia) e composição química (ácidos gordos, tocoferóis, açúcares e ácidos orgânicos). Deu-se uma maior relevância aos ácidos fenólicos e compostos relacionados que foram analisados utilizando técnicas de cromatografia e de espetrometria de massa no corpo frutífero, esporos e ainda no micélio produzido in vitro. Após a ingestão de cogumelos, os compostos mencionados sofrem reações de conjugação, tais como metilação e glucuronidação, o que pode alterar a sua estrutura e, consequentemente, as suas propriedades bioativas. Assim, sintetizaram-se possíveis metabolitos ou derivados de metabolitos de ácidos fenólicos que circulam no organismo humano, nomeadamente compostos metilados e ésteres metílicos do ácido glucurónico acetilado. Estes compostos foram completamente caracterizados utilizando técnicas de ponto de fusão, ressonância magnética nuclear 1H e 13C, e ainda espetrometria de massa de alta resolução. As propriedades bioativas dos compostos sintetizados foram avaliadas e comparadas com as dos ácidos fenólicos parentais, assim como com as dos extratos fenólicos de cogumelos. As bioatividades analisadas foram: i) atividade antioxidante, em ensaios in vitro de avaliação da atividade captadora de radicais livres, poder redutor e inibição da peroxidação lipídica; ii) atividade antimicrobiana incluindo propriedades antibacterianas e antifúngicas com determinação da capacidade desmelanizante, avaliadas por métodos de difusão em disco e de microdiluição; e iii) actividade inibitória do crescimento em diferentes linhas celulares tumorais humanas, e em células não tumorais de fígado de porco, usando uma cultura primária para avaliar a sua toxicidade, usando o método da sulforrodamina B. As espécies de cogumelos comestíveis estudadas mostraram ser uma boa opção para inclusão na nossa dieta diária dada a sua riqueza em nutrientes como glúcidos e proteínas, baixos teores calóricos e energéticos, e também por serem ricos em moléculas bioativas. Para além disso, os extratos fenólicos de cogumelos revelaram atividade antioxidante, antimicrobiana e também mostraram inibir o crescimento em linhas celulares tumorais humanas. Em geral, os derivados metilados e ésteres metílicos do ácido glucurónico acetilado mostraram maior actividade inibitória do crescimento (em linhas celulares tumorais humanas) e atividade antimicrobiana do que os respetivos ácidos fenólicos. De salientar que a atividade antimicrobiana destes possíveis metabolitos foi superior à dos antibióticos utilizados como padrões. Os resultados obtidos permitiram concluir que a inserção de grupos metilo e ésteres metílicos do ácido glucurónico acetilado nos ácidos fenólicos aumentam a sua bioatividade. No entanto, são ainda necessários mais estudos que permitam elucidar completamente os mecanismos de ação envolvidos na bioatividade destes importantes metabolitos e derivados.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)-Portugal for financial support to the Portuguese NMR network and to FCT and FEDER-COMPETE/QREN/EU for the financial support through the research project (PTDC/AGR-ALI/110062/2009) and for my PhD grant (SFRH/BD/70304/2010) that gave me the opportunity to perform this work