Strategies for increasing aroma production from castor oil by Yarrowia lipolytica

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaThe aromatic compounds produced by biotechnological processes are increasingly accepted by consumers because they are considered as “natural” compounds. In addition, they are of great interest due to the high yields obtained comparatively to chemical processes. γ-Decalactone is an aromatic compound of industrial interest, resulting from the peroxisomal β-oxidation of ricinoleic acid. This fatty acid, the major constituent of castor oil, is the precursor most commonly used in the biotechnological production of this aroma. Although there are many works described in the literature about aroma production, several factors remain to be fully understood and optimized in order to improve γ- decalactone production. Thus, this work initially aimed to study the influence of lipase in castor oil hydrolysis and the consequent impact in the aroma production. Lipozyme TL IM® revealed to be an efficient lipase to hydrolyze castor oil (95.4 % of hydrolysis in 48 h). In spite of the higher aroma concentration obtained without lipase, the process was faster when Lipozyme TL IM® was involved, resulting in similar productivities. One of the limitations in the development of an industrial process for γ-decalactone production is the toxicity of the substrate and the lactone. The immobilization by adsorption of Y. lipolytica W29 in methyl polymetacrilate and DupUm® was studied in flasks batch cultures. After selecting the best conditions for cell immobilization, free and immobilized cells were used in the biotransformation of ricinoleic acid into γ-decalactone. The results demonstrated an improvement in γ-decalactone concentration with adsorbed Y. lipolytica cells on DupUM® since a greater amount of γ-decalactone was accumulated in the medium compared to free cells. In this case the use of the extracellular lipase Lipozyme TL IM® in the biotransformation medium was crucial to allow castor oil hydrolysis, without it the substrate access to the cells would be impossible. Furthermore, immobilized cells hold a stable γ- decalactone production after being stored for 30 days at 4 ºC. Also after reuse in three consecutive biotransformations, γ-decalactone concentration was ca. 80 % of that in the first cycle, indicating that immobilized cells could be reused for at least three cycles. The production of γ-decalactone in batch cultures of Y. lipolytica W29 free cells was studied at bioreactor level and the preformance in stirred tank (STR) and airlift bioreactors was compared. The oxygen mass transfer was characterized and the positive influence of kLa on γ-decalactone productivity was demonstrated for both bioreactors. A 2-fold increase in γ-decalactone concentration was achieved in the airlift when compared to STR; but, in this last bioreactor the production rate was higher. Morphological characterization of the yeast cells by image analysis showed that pneumatic agitation causes less impact in the cells morphology than mechanical agitation. A predominance of loose cells and quite irregular structures was observed in the STR. So, the airlift bioreactor presents potential interest for larger scale production, with important cost savings, due to the reduction of power input consumption. Finally, the performance of Y. lipolytica strains with modifications in the lipid metabolism at the β-oxidation pathway (acyl-CoA oxidases) and the triglyceride hydrolysis (LIP2 overexpression) using castor oil as substrate was monitored in the STR bioreactor. Depending on genotype, degradation of γ- decalactone was prevented. Also, a faster initial rate of aroma production was obtained with strain overexpressing LIP2 due to the fast hydrolysis of castor oil and release of ricinoleic acid. Step-wise fedbatch cultures improved γ-decalactone concentration only for MTLY40-2P strain, for which a 1.7-fold increase in γ-decalactone final concentration was achieved. The present work brings new insights on the biotechnological production of γ-decalactone contributing with some different strategies for increasing aroma production leading to a greater γ- decalactone concentration.Os compostos aromáticos produzidos por via biotecnológica são cada vez mais aceites pelos consumidores, uma vez que são considerados “naturais”, sendo esta uma mais valia perante as atuais preferencias do mercado. Além disso, os rendimentos obtidos por esta via são superiores aos obtidos na produção por síntese química. A γ−decalactona é um composto aromático de elevado interesse industrial que resulta da β-oxidação peroxissomal do ácido ricinoleico. Este ácido gordo, principal constituinte do óleo de rícino, é o precursor mais utilizado para a produção biotecnológica deste aroma. Embora existam muitos trabalhos descritos na literatura neste tópico, são vários os fatores cujo efeito ainda permanace por compreender e, consequentemente optimizar podendo permitir melhorar a produção da γ-decalactona. Assim, este trabalho teve como objetivo inicial estudar a influência da lípase na hidrólise do óleo de rícino e consequente impacto na produção do aroma. Foi utilizada a enzima Lipozyme TL IM® que foi eficiente na hidrólise do óleo de rícino (95.4 % de hidrólise em 48 h). Apesar dos resultados obtidos demonstrarem que a produção de aroma mais elevada é obtida na ausência de lípase, o processo foi mais rápido quando a Lipozyme TL IM® esteve envolvida, resultando em produtividades idênticas. Uma das limitações para o desenvolvimento de um processo industrial para a produção de γ- decalactona é a toxicidade do substrato e da própria lactona. A imobilização de Y. lipolytica W29 por adsorção em polimetilmetacrilato e DupUm® foi estudada, em modo batch em matraz. Depois de selecionadas as melhores condições de imobilização, foi comparada a produção de γ-decalactona com células livres e imobilizadas. Os resultados obtidos demonstraram que a melhor abordagem para aumentar a concentração de γ-decalactona é a adsorção de células em DupUm® uma vez que, nestas condições, a acumulação de aroma obtida foi semelhante às células livres. Neste caso, a utilização da lípase extracelular Lipozyme TL IM® no meio de biotransformação foi crucial para a hidrólise do óleo de rícino, sem a qual o acesso do substrato às células seria impossível. Além disso, as células imobilizadas podem ser armazenadas até 30 dias a 4 ºC mantendo a capacidade de produção de γ- decalactona. Após reutilização das células em três biotransformações consecutivas, a concentração de γ-decalactona foi de aproximadamente 80 % do valor obtido no primeiro ciclo, indicando que as células imobilizadas podem ser reutilizadas, pelo menos, durante três ciclos. A produção de aroma com células livres de Y. lipolytica W29 em modo batch foi testada em dois biorreatores, tanque agitado (STR) e airlift. A transferencia de oxigénio foi caracterizada em ambos os reatores assim como a influência positiva do kLa na produção da γ-decalactona. A concentração de γ-decalactona duplicou no bioreactor airlift em comparação com o STR, no entanto produtividades mais elevadas são obtidas para o STR. A caracterização morfológica das células por análise da imagem mostrou que a agitação pneumática causa menos impacto na morfologia das células do que a agitação mecânica, sendo que no STR foram observadas, predominantemente, estruturas bastante irregulares. Assim, o biorreator airlift apresenta elevado interesse para a produção de aroma em grande escala uma vez que permite reduzir os custos de operação devido à redução do consumo de energia. Por fim, foi monitorizado o desempenho de estirpes mutantes de Y. lipolytica que possuem deleções génicas no metabolismo dos lípidos na via de β-oxidação (acil-CoA oxidases) e na hidrólise dos triglicéridos (subexpressão do gene Lip2), utilizando óleo de rícino como substrato. Dependendo do génótipo, a degradação da γ-decalactona foi impedida. Além disso, uma maior velocidade de produção do aroma foi observada para a estirpe que subexpressa o gene Lip2, uma vez que houve uma hidrólise mais rápida do óleo de rícino e consequente libertação do ácido ricinoleico. O modo de operação semi-contínuo com alimentação intermitente permitiu aumentar a produção de γ-decalactona apenas para a estirpe MTLY40-2P, para a qual se observou um aumento de 1.7 vezes na concentração final de γ-decalactona. Assim, o presente trabalho apresenta novas prespetivas sobre a produção biotecnológica da γ- decalactona, contribuindo com diferentes estratégias que conduziram a um aumento na produção de aroma e permitiram obter uma elevada concentração de γ-decalactona (7 g L-1).Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) bolsa de doutoramento (SFRH/BD/63701/2009). Ao Projeto “BioInd - Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and Agro-Food processes", REF. NORTE-07-0124-FEDER-000028, cofinanciado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), ao abrigo do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER)