Quantificação dos genes associados à formação do biofilme de Staphylococcus epidermis: o seu impacto na formação do biofilme e na estrutura 3D

Dissertação de mestrado em Molecular GeneticsStaphylococcus epidermidis is a common commensal coloniser of the human skin and is currently the most frequent cause of biomaterial associated infections. Several studies have attempted to identify the determinants that distinguish invasive from commensals S. epidermidis strains. Its pathogenesis is directly related to its ability to establish multi-layered and highly structured biofilms, resistant to antimicrobial agents. This bacteria expresses several protein factors that are responsible for the development of the biofilm, including the contribution of specific factors (icaA, aap and bhp genes) in the accumulation phase. In the last years, several research groups have been trying to understand the contribution of biofilm-associated genes involved in biofilm formation. Therefore, the aim of this thesis was to analyse the gene expression of icaA, aap and bhp and compare with the formation of the biofilm structure. Two S. epidermidis strains, one isolated from a hospital environment and another from the skin of a healthy person were characterized at the level of biofilm formation, at different times of incubation. According to our results, both strains demonstrated an increase of biomass production over time, revealing the importance to use screening assays with more than 24 h of incubation. A biofilm structure analysis was also performed to detect the presence of poly-N-acetylglucosamine (PNAG), the major component of S. epidermidis biofilm matrix. The results demonstrated a higher production of PNAG only after 48 h for SECOMO034.A1. Due to the low sensitivity of the method or low quantity of proteins produced, it was not possible to determine the concentration of proteins in the biofilm matrix. Finally, the gene expression at two different biofilm formation times were determined, confirming the importance of the icaA gene in the accumulation stage, explaining the high production of biomass and PNAG. On the other hand, the aap and bhp expression levels raised some questions about their role in the biofilm process.Staphylococcus epidermidis é um colonizador comensal comum da pele humana e é atualmente a causa mais frequente de infeções associadas a biomateriais. Vários estudos têm tentado identificar os fatores determinantes que diferenciam as estirpes invasivas de S. epidermidis das comensais. A patogenicidade desta bactéria está diretamente relacionada com a sua capacidade de formar biofilmes altamente estruturados e resistentes a agentes antimicrobianos. Esta bactéria expressa diversos fatores que são responsáveis pelo desenvolvimento do biofilme, incluindo fatores específicos (genes icaA, aap e bhp) na fase de acumulação. Nos últimos anos, vários grupos de investigação têm tentado compreender a contribuição dos genes que estão envolvidos na formação do biofilme. O objetivo desta dissertação consistiu na análise da expressão dos genes icaA, aap e bhp e sua comparação com a formação e a estrutura do biofilme. Duas estirpes de S. epidermidis, uma isolada de um ambiente hospitalar e outra a partir de uma pessoa saudável, foram caracterizadas ao nível da formação de biofilme, a diferentes tempos de incubação. De acordo com os nossos resultados, ambas as estirpes demonstraram um aumento de produção de biomassa ao longo do tempo, revelando a importância de utilizar ensaios de rastreio com mais de 24 h de incubação. Uma análise da estrutura do biofilme também foi realizada para detetar a presença de poly-N-acetilglucosamina (PNAG), o componente principal da matriz de biofilmes de S. epidermidis. Os resultados demonstraram uma elevada produção de PNAG somente após 48 h, na estirpe SECOMO034.A1. Em conjunto, também se tentou visualizar as proteínas extra-celulares na matriz do biofilme. Contudo, não foi possível esta análise, provavelmente devido à baixa sensibilidade do método. Por fim, foi determinada a expressão dos genes a dois tempos de formação de biofilme diferentes, confirmando a importância do gene icaA na fase de acumulação e explicando a elevada produção de biomassa e PNAG. Por outro lado, os níveis de expressão dos genes aap e bhp não foram claramente associados à crescente acumulação de biofilme ao longo do tempo.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Project PEst-OE/EQB/LA0023/2013.Project “BioHealth - Biotechnology and Bioengineering approaches to improve health quality", Ref. NORTE-07-0124-FEDER-000027.QREN.FEDER.Project “Consolidating Research Expertise and Resources on Cellular and Molecular Biotechnology at CEB/IBB”, Ref. FCOMP-01-0124-FEDER-027462 and the FCT grant SFRH/BD/66166/2009