Unraveling the biological role of neudesin, a novel neurotrophic factor

Tese de doutoramento Ciências da SaúdeNeudesin, also known as neuron derived neurotrophic factor (NENF), is a non-canonical neurotrophic factor. Since it presents a heme/steroid binding domain in its structure, NENF is also a member of the membrane associated progesterone receptor (MAPR) family. In vitro studies have shown that recombinant NENF per se is able to induce proliferation and differentiation of embryonic cortical neurons and respective precursor cells. Of note, the addition of hemin to the media significantly increased the neurotrophic capacity of NENF in vitro, showing that heme successfully binds to NENF primary structure and indicating that heme is a prosthetic group needed for NENF activity, at least in vitro. Nevertheless, still much is unknown on the mechanism of action of NENF. Furthermore in vivo studies on NENF function are yet scarce. In this thesis, we have evaluated the importance of NENF for central nervous system (CNS) postnatal development and in adulthood, specifically at the behavioral, neurochemical and structural levels. Furthermore we characterized the adult neurogenic niches in the absence of NENF. For that, we have taken advantage of a unique mouse model with a target deletion of the entire neudesin gene, from now on designated as neudesin-null mice. We observed that in the absence of NENF, adult males have an anxious-like behavior, as it was assessed in the elevated plus maze (EPM), light/dark box (LDB) and novelty suppressed feeding (NSF) tests; surprisingly we have not seen the same anxious phenotype in the acoustic startle (AS) test. These results reveal a role for NENF in the regulation of state anxiety but not in generalized anxiety, at least in males. On the other hand, neudesin-null males do not show any motor, exploratory, depressive or cognitive alterations. This anxious phenotype was accompanied by impoverished dendritic arborization of ventral hippocampal granular cells as well as impaired dopaminergic activity, and shorter dendrites at the anterior medial division of the bed nucleus of the stria terminals (amBNST). These observations reveal a critical role for NENF in the maintenance of the anxiety circuitry, especially at the ventral hippocampus. Since neurodevelopment is highly regulated by neurotrophic factors, and might impact on adult behavior we have studied the postnatal acquisition of developmental milestones of neudesin-null animals during the first 21 days of postnatal life. We observed sex-differences regarding specific neurological reflexes dependent on the vestibular area maturation, with a mild delay on neurodevelopment observed only in neudesin-null males. This was followed by a neurochemical imbalance, evaluated in postnatal day 21, in body righting and position regulating brain regions. Specifically we observed that the brain stem of neudesin-null males showed increased serotonin and norepinephrine, a decreased serotonergic and dopaminergic activity in the cerebellum, diminished norepinephrine in the motor cortex and the vestibular area revealed less dopaminergic activity. Lastly we have characterized the proliferative capacity of neudesin-null mice neurogenic niches, in vivo and in vitro. We observed a sex difference in proliferation occurring in the sub granular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. Neudesin-null male mice showed less labeling of BrdU cells than littermate controls, which was not observed in females. Assessing neurogenesis ratio by doublecortin (DCX) and BrdU positive cells, we have observed that neudesin-null males showed less neurogenesis only in the ventral division of the hippocampus. Furthermore, in vitro we observed that neurospheres formed by neural stem cells derived from the hippocampus of neudesin-null mice had an inferior clonal expansion capacity. All these evidences prompt us to propose that NENF might also have neurotrophic capacity in vivo, specifically at the ventral division of the hippocampus, but interestingly its importance is primordial in males. With this work we contributed to further unravel the biological role of NENF in the CNS.A neudesina, também designada por factor neurotrófico derivado de neurónios (NENF), é uma proteína com atividade neurotrófica. Esta tem na sua estrutura primária um domínio de ligação a grupos heme e esteroides que a classifica como um membro da família de proteínas dos receptores de progesterona associados à membrana (MAPR). Estudos in vitro demonstraram que a NENF per se é capaz de induzir proliferação e diferenciação de neurónios derivados do córtex embrionário e também das respetivas células precursoras desses neurónios. De salientar que a adição de hemina ao meio de cultura aumentou significativamente a capacidade neurotrófica da NENF, demonstrando que in vitro, a hemina se liga ao domínio da NENF e que atua como um grupo protético necessário para a atividade da NENF. No entanto, ainda muito pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da NENF in vivo. Neste estudo, avaliamos a importância da NENF no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) adulto e pós-natal, especificamente ao nível do comportamento, neuroquímica e estrutura. Adicionalmente caracterizamos os nichos neurogénicos adultos na ausência de NENF. Para tal, utilizamos um modelo animal de murganho sem o gene da neudesina, que daqui em diante designaremos de NENF-/-. Observamos que na ausência de NENF, os machos adultos têm um comportamento ansioso, observado em 3 diferentes testes que aferem os níveis de ansiedade contextualizada mas não num outro teste que afere a ansiedade generalizada. Isto sugere um papel para a NENF como modelador do comportamento ansioso contextualizado, o que envolve circuitos cerebrais específicos. Por outro lado, animais sem NENF não mostraram qualquer problema motor/exploratório, depressivo ou cognitivo. O fenótipo ansioso foi acompanhado por uma atrofia da arborização dos neurónios granulares do girus denteado do hipocampo ventral e também por uma desregulação da atividade dopaminérgica nesta região e assim como por dendrites mais curtas dos neurónios da divisão anterior medial do núcleo da estria terminal. Estas alterações revelam um papel crítico para a NENF na manutenção do circuito da ansiedade, especialmente no hipocampo ventral. Como o neurodesenvolvimento é regulado por fatores neurotróficos, estudamos a aquisição de marcos específicos do desenvolvimento pós-natal dos murganhos NENF-/- durante os primeiros 21 dias de vida. Observamos uma diferença dependente do género em alguns reflexos neurológicos dependentes da maturação da área vestibular. Apenas os machos apresentam um atraso na aquisição destes reflexos. Este atraso foi acompanhado por uma desregulação neuroquímica avaliada no dia pós-natal 21, em áreas do cérebro envolvidas em mecanismos de equilíbrio e posição do corpo. Especificamente, observamos um aumento de serotonina e norepinefrina no tronco cerebral de animais NENF-/-, assim como um aumento da atividade serotonérgica e dopaminérgica no cerebelo, diminuição de norepinefrina no córtex motor e uma diminuição da atividade dopaminérgica na área vestibular. Por fim, caracterizamos a capacidade proliferativa dos nichos neurogénicos de animais NENF-/-, in vivo e in vitro. Observamos uma diferença dependente do género na proliferação na zona sub granular do girus denteado do hipocampo. Os machos NENF-/- apresentam menos células BrdU positivas do que os controlos, o que não se observa nas fêmeas. Na avaliação da neurogénese pela contagem de neuroblastos em proliferação, observamos que os machos NENF-/- apresentam menos neurogenese a ocorrer apenas na divisão ventral do hipocampo. Adicionalmente, in vitro observamos que neuroesferas formadas a partir de células estaminais do hipocampo de animais NENF-/- apresentam uma capacidade clonal inferior. Este conjunto de evidências, leva-nos a propor que a NENF possui também capacidade neurotrofica in vivo, especificamente na divisão ventral do hipocampo apenas em machos. Com este trabalho contribuímos para clarificar um pouco mais o papel da neudesina no sistema nervoso central