In vivo metabolic pathway analysis of Enterococcus faecalis for uncovering key pathogenicity factors

Tese doutoramento em "Chemical and Biological Engineering"In spite of the increasing progress in the fight against prokaryotic pathogens, numerous bacteria play a significant concern for human health. Most of the current knowledge has been on isolated biochemical reactions or pathways exposed to a potential stress likely to be encountered in the host. Enterococci are equipped with a variety of intrinsic (i.e., naturally occurring) antibiotic resistances, but are also capable of acquiring new resistance genes and / or mutations. The present thesis aimed to gather knowledge on the pathogenic bacterium Enterocccus faecalis using genomics and post-genomics technologies and continuous culture techniques to study the behaviour of the complete biological system (bacterial cell) in vivo under different environmental perturbations. The knowledge obtained, together with the annotated genome sequence of E. faecalis was used to develop the first genome-scale mathematical model that will hopefully serve as a valuable tool to explore the metabolism of the organism and help unravel hidden metabolic pathways essential for bacterial growth and survival. The experiments carried out allowed testing two Enterococcus faecalis strains against the oxidative stress imposed in the form of oxygen and hydrogen peroxide while varying the dilution rate. The first line defence was observed to be a shift in the glycolytic pathway, the pentose phosphate pathway and glutathione production while the downstream response was imposed on the fatty acid metabolism and demethylmenaquinone biosynthesis. The first genome-scale reconstruction of this organism involved a pipeline of extremely laborious tasks that comprised the assembly of all the metabolic reactions encoded on the annotated genome sequence, the manual curation of the information collected and the refinement of the network to allow the model to simulate and further test the capabilities of the network. This model aimed to predict in silico, the capabilities expressed by this organism in vivo. Indeed, the simulations carried out were able to accurately predict the qualitative behaviour of this organism evidenced by the metabolic distribution shift observed in the simulations of homolactic and heterolactic metabolism or under aerobic and anaerobic environment.Apesar do crescente progresso na luta contra agentes patogénicos, são inúmeras as bactérias que desempenham um papel significativo na saúde humana. O atual conhecimento tem sido obtido através da análise de reações bioquímicas isoladas ou das vias expostas a uma condição de estresse passível de ser encontrada no hospedeiro. O género enterococos está intrinsecamente equipado com uma grande variedade de resistências a antibióticos, mas é igualmente capaz de adquirir novos genes de resistência e / ou mutações A presente tese teve como objetivo explorar o metabolismo do patogénico Enterococcus faecalis, utilizando para o efeito tecnologias na área da genómica e pós-genómica acopladas a técnicas de cultura contínua para estudar o comportamento do sistema biológico completo (célula bacteriana) in vivo sujeito a diferentes perturbações. O conhecimento obtido, juntamente com o recurso à sequência anotada do genoma da E. faecalis permitiu desenvolver o primeiro modelo à escala genómica que pretende ser uma ferramenta valiosa para explorar o metabolismo do organismo e ajudar a revelar novas vias metabólicas essenciais para o crescimento bacteriano e a sua sobrevivência. As experiências levadas a cabo com duas estirpes de Enterococcus faecalis analisaram a resposta metabólica ao estresse oxidativo, aplicada sob a forma de oxigénio e de peróxido de hidrogénio conjuntamente com uma variação da taxa de diluição. Observou-se que a primeira linha de defesa em resposta ao estresse foi uma mudança na via glicolítica, a via das pentoses fosfato e da produção de glutationa, enquanto a resposta a jusante foi imposta sobre o metabolismo dos ácidos gordos e biossíntese de demetilmenaquinona. A reconstrução do primeiro modelo à escala genómica deste organismo envolveu tarefas laboriosas e complexas num processo iterativo. Todas as reações metabólicas codificadas na sequência genómica foram recolhidas, seguida da sua curação manual e posterior refinamento da rede para obter um modelo simulável capaz de testar as capacidades da rede. Este modelo pretende prever in silico as capacidades expressas in vivo por este organismo. As simulações realizadas foram capazes de prever com precisão o comportamento qualitativo deste organismo evidenciando uma distribuição metabólica característica de um metabolismo homolático e heterolático ou em ambiente aeróbio e anaeróbio