Investigação da produção do ácido itacónico pela bactéria Escherichia coli

Dissertação de mestrado em BioengenhariaO ácido itacónico (AI) é um ácido carboxílico que apresenta elevado potencial para ser usado como monómero na síntese de diversos materiais sintéticos. Actualmente, é produzido por fermentação com fungos filamentosos, obtendo-se rendimentos mais elevados em comparação com outras espécies, nomeadamente bacterianas. Entre as diversas espécies de fungos, o Aspergillus terreus e o Aspergillus niger são as que apresentam melhores níveis de produção deste ácido (> 80g.L-1). No entanto, em comparação com o processo de produção de ácido cítrico (> 200 g.L-1) utilizando estes mesmos fungos, a produtividade é consideravelmente mais baixa. Existe por isso a necessidade de um desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de fermentação e a procura de novas estirpes produtoras, incluindo organismos geneticamente modificados, de modo a melhorar o processo biológico. O AI é sintetizado através da atividade catalítica da cis-aconitato descarboxilase (CAD), cujo gene pode ser isolado de uma vasta gama de fungos filamentosos. A sua clonagem em organismos hospedeiros, como as bactérias, possibilita a produção de AI usando plataformas microbianas com melhores características para a implementação industrial, essencialmente no que respeita às condições operacionais. A abordagem deste trabalho parte do facto da Escherichia coli ser actualmente reconhecida como uma das plataformas microbianas adequadas à produção recombinante de diversos produtos, incluindo ácidos orgânicos tais como o AI. O efeito do AI na fisiologia e no metabolismo da E. coli em cultura com diferentes substratos foi inicialmente testado. Os resultados apontam que o AI não deverá ser usado como fonte de carbono pela E. coli, facto que poderia afectar a produtividade final do processo, mas afecta o crescimento celular da E. coli quando se usam fontes de carbono gluconeogénicas, nomeadamente acetato. Posteriormente, foi avaliada a capacidade de produção de uma estirpe de E. coli recombinante BL21(DE3) pET52-CAD com o gene CAD de A. terreus. Nestes ensaios foram testadas apenas as condições de pH do meio fermentativo, dado ser um dos factores mais relevantes na produção de AI. Os resultados mostram que a gama de pH testada não terá efeito na produção de AI, mas afecta a formação de biomassa. Os níveis de produção obtidos (0,034 g.L-1) estão ainda muito abaixo de outros processos de produção (80 g.L-1 em A. terreus). Embora os resultados de produção sejam pouco promissores, deve ter-se em conta a necessidade de testar outras condições fermentativas para avaliar a produção óptima de AI em E. coli. Para além disso, existe a possibilidade de manipulação da E. coli por meio de estratégias de engenharia metabólica, que abre novas expectativas relativamente à optimização deste processo.Itaconic acid (IA) is a carboxylic acid with a high potential to be used as a monomer in the synthesis of various materials. Currently, IA is produced by fermentation using filamentous fungi, providing high product yields compared to other microorganisms, particularly bacteria. Among the fungal species, Aspergillus terreus and Aspergillus niger present the best production levels (> 80g.L- 1), but titers are still lower compared to the production of citric acid with fungi (>200 g.L-1). Therefore, there is a need for a continuous development of new fermentation technologies and the search for new strains, including genetically modified strains to enhance the production of IA. The IA is synthesized through the enzymatic activity of cis-aconitate decarboxylase (CAD), whose gene can be isolated from a wide range of filamentous fungi, but preferentially from A. terreus. Cloning the CAD gene in host organisms, like E. coli, allows the production of IA by organisms that present more favorable properties for the industrial production, mainly with regards to operating conditions and costs associated with the industrial process. The purpose of this work relies on the fact that E. coli has been recognized as a wellestablished platform for the microbial production of various recombinant products, including organic acids and, as such, may also be interesting for the production of IA at the industrial-scale. Thus, the investigation of the IA effects on the physiology of E. coli cells grown at different conditions (i.e., carbon sources) was prioritized, so that we could understand the most favorable conditions for the production of IA in E. coli. The results pointed out that IA may not be used as a carbon source, a fact that would affect the final yield of the process, but limits cell growth when using gluconeogenic carbon sources. Then, a recombinant E. coli BL21 (DE3) pET52-CAD strain with the CAD gene from A. terreus was used to evaluate the production of IA. In these assays, different pH conditions were tested, which revealed no effects on the production of IA at the range of pH values tested. Although the recombinant activity of CAD was not affected, the cell growth was; which indicates the potential activation of cellular mechanisms, perhaps to maintain the intracellular pH that affect cellular growth. The production levels obtained (0.034 g.L1) were still much lower compared with other production process (for example 80g.L-1 in A. terreus), but metabolic engineering strategies opens new promising perspectives for the optimization of this process