Microbiology of thermophilic anaerobic syngas conversion

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaBiological syngas fermentation can be used for novel biotechnological applications. Syngas can be produced from biomass and recalcitrant wastes; fermentation of this gas is therefore an environmentally friendly process with foreseen applications in the production of biofuels and chemicals. This thesis reports the use of thermophilic anaerobic mixed cultures for syngas and carbon monoxide (CO) conversion, as well as the isolation and characterization of two new thermophilic bacterial strains - one CO-utilizing bacterium and one CO-tolerant bacterium. Stable thermophilic enrichments converting syngas or CO at 55 oC were obtained by long term exposure of a thermophilic anaerobic suspended sludge to these substrates. Enrichments were successively transferred (for over a year) with syngas and pure CO, as sole carbon and energy source. CO partial pressure was increased from 0:09 to 0:88 bar during the enrichment procedure. Enrichment cultures initiated with syngas produced mainly acetate, while hydrogen was the main product detected in enrichment cultures initially incubated with CO. Bacteria branching within the families Peptococcaceae and Thermoanaerobacteraceae were present in syngas and CO enrichment cultures. Syngas enrichment cultures were composed of two predominant species related to Desulfotomaculum and Caloribacterium genera, while bacteria assigned to Thermincola and Thermoanaerobacter genera were abundant in CO enrichment cultures. The e ect of sulfate on CO conversion by the obtained syngas-degrading enriched culture was also investigated. Although the enrichment culture could convert CO into mainly acetate both in the presence and in the absence of sulfate, CO conversion was faster when sulfate was present. Identi cation of the predominant microorganisms revealed the presence of Desulfotomaculum-like bacteria. A novel CO-tolerating bacterium, Thermoanaerobacter carboxyditolerans, was isolated from the syngasdegrading enriched culture. This bacterium is closest related to Thermoanaerobacter thermohydrosulfu- ricus (97% identity based on 16S rRNA gene sequence). Although T. carboxyditolerans does not utilize CO, it is able to grow in the presence of high CO concentrations (pCO = 1:7 bar). Other Thermoanaer- obacter species showed tolerance to CO, namely T. thermohydrosulfuricus, T. brockii subsp. nnii, T. pseudethanolicus and T. wiegelii ; growth of these bacteria was not substantially a ected by CO concentrations ranging from 25% to 100% (pCO from 0:425 to 1:7 bar). Nevertheless, hydrogen production by those species decreased with increasing CO partial pressure. A new thermophilic hydrogenogenic carboxydotrophic bacterium, Moorella stamsii, could be isolated from the CO-degrading enrichment. This bacterium is able to utilize CO coupled to the production of hydrogen. M. stamsii is phylogenetically related to Moorella glycerini (97% identity based on 16S rRNA gene sequences). With this PhD research we gained insight in the ecophysiology of thermophilic anaerobic conversion of syngas and CO. Results presented in this thesis are important for prospecting biotechnological processes for the production of added-values compounds, such as hydrogen and/or acetate.A fermentação biológica de gás de síntese pode ser usada como um novo processo biotecnológico para produção de biocombustíveis. O gás de síntese pode ser produzido a partir de biomassa florestal ou de resíduos recalcitrantes; a fermentação biológica deste gás é um processo ambiental e economicamente sustentável, com potenciais aplicações na produção de biocombustíveis e outros compostos químicos de elevado interesse. Nesta tese são descritos estudos que utilizam culturas mistas, em condições termofílicas, com o objetivo de estudar a conversão de gás de síntese e de monóxido de carbono (CO) por essas culturas. Descreve-se também o isolamento e caracterização fisiológica de duas novas bactérias; uma das bactérias isoladas è capaz de utilizar o CO e a outra é tolerante a elevadas concentrações de CO. Culturas estáveis e enriquecidas em gás de síntese ou CO, em condições termofílicas 55º C foram conseguidas após longa exposição da biomassa suspensa anaeróbia (usada como inóculo) a estes substratos. As culturas foram sucessivamente transferidas para meio novo (durante mais de um ano), com gás de síntese ou CO como única fonte de carbono e energia. Durante o processo de enriquecimento das culturas, a pressão parcial de CO foi aumentando, começou por 0:09 bar até atingir 0:88 bar. As culturas iniciadas com gás de síntese como substrato, produziram maioritariamente acetato, enquanto que as culturas que foram inicialmente incubadas com CO produziram maioritariamente hidrogénio. Verificou-se que a comunidade bacteriana dominante presente nas culturas enriquecidas em gás de síntese e CO pertence às famílias Peptococcaceae and Thermoanaerobacteraceae. Os enriquecimentos em gás de síntese apresentaram duas espécies dominantes, filogeneticamente relacionadas com os genéros Desulfotomaculum e Caloribacterium, enquanto que bactérias pertencentes aos géneros Thermincola e Thermoanaerobacter estavam abundantemente presentes nos enriquecimentos em CO. O efeito do sulfato na conversão de CO pela cultura enriquecida em gás de síntese anteriormente obtida foi também objeto de estudo. Embora a cultura enriquecida consiga converter CO em acetato nas duas condições testadas (presença/ausência de sulfato), a utilização de CO foi mais rápida na presença de sulfato. A identificação dos microrganismos predominantes revelou a presença de organismos filogeneticamente próximos do género Desulfotomaculum. A partir da cultura enriquecida em gás de síntese foi isolada uma nova bactéria: Thermoanaerobacter carboxy- ditolerans. Esta bactéria está filogeneticamente relacionada com Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (97% similaridade, com base na sequência do gene 16S). T. carboxyditolerans não utiliza CO, mas tem a capacidade de crescer na presença de altas concentrações de CO (pCO = 1:7 bar). Outras espécies do género Thermoanaerobacter (T. thermohydrosulfuricus, T. brockii subsp. nnii, T. pseudethanolicus e T. wiegelii) apresentaram também tolerância ao CO. O crescimento destas bactérias não foi significativamente afetado pela presença de CO em concentrações que variavam entre 25% a 100% de CO (pCO entre 0:425 e 1:7 bar). No entanto, verificou-se a diminuição da produção de hidrogénio, com o aumento da pressão parcial de CO no meio. Uma nova bactéria termofílica, hidrogenogénica, carboxidotrófica, Moorella stamsii, foi isolada a partir da cultura enriquecida em CO. M. stamsii consegue converter o CO em hidrogénio. E filogenticamente próxima de Moorella glycerini (97% similaridade, com base na sequência do gene 16S). Com os trabalhos de investigação decorrentes deste doutoramento, aumentamos os nossos conhecimentos relativamente à ecologia, fisiologia e microbiologia da conversão anaeróbia do gás de síntese e do monóxido de carbono, em condições termofílicas. Os resultados obtidos neste trabalho foram importantes, numa perspetiva futura de aplicar processos biotecnológicos para a produção de compostos com interesse, como o hidrogénio ou o acetato