Structural-functional studies of carboxylic acid transporters : novel tools in production optimization using industrial microbes

Dissertação de mestrado em Molecular GeneticsThe rising global energy demands in last century drive to worrying depletion levels of fossil fuels, leading to a growing interest in microbial biofuel synthesis, particularly in model organisms like Saccharomyces cerevisiae. The microbial conversion of sugars to biofuels is a promising technology, thus envisaging for more efficient metabolic pathways has been attempted. Indeed byproducts of biomass pretreatment processes and the biofuels themselves are often toxic at industrially-relevant levels., therefore efforts to improve production yield by engineering efflux systems to overcome toxicity problems and secret inhibitory chemicals from the cell has been revealed as a crucial alternative. In this scope, the aim of the present work was to screen a wide range of promising membrane transporters for the transport of carboxylic acids, particularly for xylonic acid, mucic acid, saccharic acid, gluconic acid and xylaric acid in the yeast S. cerevisiae. During this study a considerable number of membrane proteins, known as carboxylic acid transporters from different yeasts species were screened and functionally characterized in regard to the transport of mono- and dicarboxylic acids with biotechnological application, such as xylonic and gluconic acids, and saccharic, mucic and xylaric acids, respectively. Among the transporters tested, we have found evidences for the transport of four carboxylic acids, mucic, xylaric, gluconic and saccharic acids with the following specificities: gluconic acid (Ki of 13.2 mM and 40.6 mM), xylaric acid (Ki of 27.6 mM), mucic acid (Ki of 32.9 mM) and saccharic acid (Ki of 24.1 mM and 24.7 mM). These results revealed to be very promising for future work aiming at engineering proper microbial strains with increased ability to export biofuel acids to external medium.A crescente procura de combustíveis fósseis a que se assistiu no último século levou a que se atingissem limites de exploração preocupantes, redirecionando a atenção para a síntese microbiana de biocombustíveis, em particular através organismo modelo Saccharomices cerevisiae. A conversão microbiana de açúcares em biocombustíveis temse revelado uma tecnologia promissora, pelo que novas tentativas de melhorar a eficiência das vias metabólicas envolvidas no processo de síntese têm sido testadas. Tanto os produtos resultantes do processamento de biomassa como os próprios biocombustíveis exercem regularmente um efeito tóxico na produção à escala industrial. Nesse sentido, importantes esforços têm sido levados a cabo para desenvolver novos sistemas de efluxo com o intuito de reduzir problemas de toxicidade e conduzir para o exterior da célula diferentes compostos químicos. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho é desvendar o potencial de diferentes transportadores de membrana para o transporte de ácidos carboxílicos em S. cerevisiae. Ao longo deste estudo, várias proteínas de membrana, conhecidas como transportadores de ácidos carboxílicos provenientes de diferentes espécies de leveduras foram testadas e caracterizadas funcionalmente no que respeita ao transporte de ácidos mono e dicarboxílicos com interesse biotecnológico, tais como ácidos xilónico e glucónico, e ácidos sacárico, mucico e xilárico, respetivamente. De entre os transportadores testados foram encontradas evidências para o transporte de quatro ácidos carboxílicos, a saber os ácidos mucico, xilárico, glucónico e sacárico com as respetivas especificidades: ácido glucónico (Ki de 13,2 mM e 40,6 mM), ácido xilárico (Ki de 27,6 mM), ácido mucico (Ki de 32,9 mM) e ácido sacárico (de 24,1 mM e 24,7 mM). Estes resultados revelam-se bastante promissores para futuros estudos que envolvam a obtenção de estirpes microbianas com capacidade desenvolvida para excretar biocombustíveis