Uncovering abiotic stress responses in Arabidopsis thaliana

Dissertação de mestrado em Plant Molecular Biology, Biotechnology and BioentrepeneurshipLiving organisms are constantly subjected to adverse environmental conditions that have negative effects, compromising their survival. Exposed to a multiplicity of stimuli that include temperature, drought, salinity and even hormone stimuli, plants had to develop complex mechanisms that require stress signaling pathways and gene expression regulation, providing functional and structural protein protection and allowing the re-establishment of cellular homeostasis. Nearly all of these responses act transiently, aiming towards tolerance or even resistance. Following stress perception, a signal transduction cascade is triggered, leading to the transcriptional control of stress‐related genes and also other regulatory levels that include chromatin remodeling, mRNA fate and post-translational modification of proteins. Functional studies in Arabidopsis thaliana have been pivotal to clarify the protection mechanisms and the role of each gene in each stress-responsive pathway. Phenotypic characterization of Arabidopsis thaliana gain- and loss-of-function mutants is a delicate and meticulous task that often involves the analysis of multiple parameters. In particular, Arabidopsis heat tolerance has been evaluated based on direct assessments that include seed germination, seedling survival, hypocotyl and root elongation, or indirect measurements such as chlorophyll content or ion leakage. In an attempt to simplify the detection of heat stress-associated phenotypes, a collection of protocols for analysis of seed germination and seedling survival to heat treatment is proposed. Temperatures and lengths of heat treatments were combined to develop several heat tolerance assays to be used as a primary approach for the search and characterization of basal and acquired heat tolerance-associated phenotypes at early developmental stages. The usefulness of this methodology was illustrated through the characterization of heat-related phenotypes in different Arabidopsis ecotypes as well as in gain- and loss-of-function mutants. The small ubiquitin-like modifier SUMO is a peptide that acts transiently to modify target proteins following abiotic stress, and SUMO-conjugate levels strongly correlate with the intensity and duration of this stress. Several reports evidence that the SUMO E3 ligase SIZ1 is determinant for plant development and environmental stress responses, and the siz1 null mutant has become a major tool in sumoylation studies. Ethylene is a crucial hormone involved in plant development and was hypothesized to functionally correlate with sumoylation. In an attempt to characterize SUMO and ethylene convergence, a series of in silico studies were performed to map points of SUMO crosstalk within the ethylene signaling pathway. Standard phenotype characterization assays were made to establish the response of siz1 and ein3 eil1 double mutants to the ethylene precursor, ACC, and to assess to impact of siz1 on chloroplast functioning. In order to achieve a better understanding and establish the epistatic relationships between ethylene signaling and the posttranslational modification by SUMO, the triple mutant siz1 ein3 eil1 was generated for future experiments. In parallel, gene copies of the EIN3 and EIL1 ethylene-associated transcription factors were cloned into pET28b as a step towards their validation as SUMO targets.Os seres vivos são constantemente sujeitos a condições ambientais adversas que surtem eleitos negativos, comprometendo a sua sobrevivência. Expostas a uma multiplicidade de estímulos que incluem a temperatura, secura, salinidade e mesmo estímulos hormonais, as plantas tiveram que desenvolver mecanismos complexos como vias de sinalização de stresse e regulação da expressão génica, garantindo a protecção estrutural e funcional das proteínas e restabelecendo a homeostasia celular. Quase todas estas respostas a stresses actuam transientemente, com o objectivo de atingir tolerância ou mesmo resistência. Depois da percepção do stresse são desencadeados uma série de eventos de transdução de sinal que influenciam não só o controlo da transcrição de genes envolvidos no stresse mas também outros níveis de regulação, que incluem a remodelação da cromatina, destino de mRNA e modificação póstranslacional de proteínas. Os estudos funcionais em Arabidopsis thaliana têm sido cruciais para o esclarecimento destes mecanismos de protecção e o papel de cada gene em cada via de resposta ao stresse. A caracterização fenotípica de mutantes de ganho- ou perda-de-função de Arabidopsis thaliana é uma tarefa delicada e meticulosa que, muitas vezes, envolve a análise de múltiplos parâmetros. Particularmente, a tolerância de Arabidopsis ao calor tem sido avaliada de uma forma imediata que inclui a avaliação da germinação, da sobrevivência de plântulas e do alongamento do hipocótilo e da raiz, mas também através de medições indirectas como o teor em clorofila e o escoamento de iões. Numa tentativa de simplificar a detecção de fenótipos associados ao stresse pelo calor, é proposta uma gama de protocolos para a análise da germinação e da sobrevivência das plântulas. Foram combinadas diferentes temperaturas e durações do tratamento térmico, com o objectivo de desenvolver vários ensaios que poderão ser usados como uma primeira abordagem para a procura e caracterização de fenótipos associados tanto à termotolerância basal como à adquirida, nos estágios primordiais do desenvolvimento. A utilidade desta metodologia foi demonstrada através do uso de ecótipos e mutantes perda-de-função de Arabidopsis na caracterização de fenótipos associados ao calor. O small ubiquitin-like modifier (SUMO) é um pequeno péptido que actua transientemente na modificação de proteínas alvo após exposição a stresse abiótico, sendo que os níveis de SUMO-conjugados são fortemente correlacionados com a intensidade e duração deste mesmo stresse. Vários artigos evidenciam a importância da SUMO E3 ligase SIZ1 para o desenvolvimento da planta e para a resposta aos stresses ambientais e ainda da utilidade do uso do mutante perda-defunção siz1 em estudos de sumoilação. Por sua vez, o etileno é uma hormona crucial no desenvolvimento da planta, tendo sido teorizada uma correlação funcional com a via de sumoilação. Numa tentativa de caracterizar a convergência entre o SUMO e o etileno, uma serie de estudos in silico foram efectuados para identificar os pontos em que a via da sumoilação e da sinalização do etileno se cruzam. Foram efectuados ensaios de caracterização de fenótipo para estabelecer a resposta do mutante siz1 e do duplo mutante ein3 eil1 ao percursor do etileno, ACC, e ainda para avaliar o impacto de siz1 no funcionamento do cloroplasto. Com o objectivo de perceber melhor e estabelecer as relações epistáticas existentes entre a sinalização do etileno e a modificação pós-translacional pelo SUMO, o triplo mutante siz1 ein3 eil1 foi gerado para ser alvo de experiências futuras. Ao mesmo tempo, cópias génicas dos factores de transcrição associados ao etileno, EIN3 e EIL1, foram clonados em pET28b como o primeiro passo em direcção à sua validação como alvos de SUMO