Effects of ataxins-3 loss and gain of function : characterization of neuronal cell lines overexpressing wild-type and mutant forms of mutant ataxin-3

Dissertação de mestrado em Genética MolecularMachado-Joseph Disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is an autosomal dominant neurodegenerative disorder which involves the cerebellar, pyramidal, extrapyramidal, motor neuron and oculomotor systems. MJD is caused by an expanded CAG repeat in the coding region of the ataxin-3 gene; for this reason it belongs to the group of polyglutamine (polyQ) associated diseases. The normal function of the ataxin-3 protein (ATXN3) remains mostly unknown, although there are some data suggesting a role for this protein in the modulation of protein degradation (either by the UPS or through autophagy) in association with its deubiquitylase (DUB) activity. Other evidence suggests a role in transcription regulation, in the cellular response(s) to stress and in the cytoskeleton organization as well as in cellular adhesion. In this work we studied the normal function of ATXN3 in neurons, using a novel neuroblastoma SH-SY5Y cell-based approach. We characterized all the different cell lines, assessing cell differentiation and survival, morphology, adhesion and cytoskeleton features, in cells overexpressing wild-type (ATXN3_28Q) and expanded (ATXN3_83Q) ATXN3 as well as cells expressing a catalytic mutant version of this protein (ATXN3_C14A). We also evaluated the transcriptomic profile and protein expression of the cell lines and further investigated the pathways underlying the cellular changes and cytoskeletal regulators. Moreover, in cells expressing both mutant and expanded ATXN3, we found a decreased expression of α-5 integrin (ITGA5) and inhibition of its downstream partners’ activity. The findings described in this study led us to hypothesize that the DUB activity of ATXN3 underlie the neuronal phenotype regulation and also that the expansion of the polyQ tract causes partial loss of function.A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como ataxia espinocerebelar 3, é uma desordem autossómica dominante que envolve os sistemas cerebelar, piramidal, extrapiramidal, motor neuronal e oculomotor. A DMJ é causada por uma expansão no codão CAG na região codificante do gene da ataxina-3; por esta razão, pertence ao grupo das doenças associadas às poliglutaminas (poliQ). A função normal da proteína ataxina-3 permanece desconhecida, embora alguns dados sugiram um papel da modulação da degradação proteica (quer pelo UPS ou por autofagia) em associação com a sua actividade como deubiquitilase (DUB). Outras evidências apontam para funções relacionadas com regulação da transcrição, como resposta celular ao stress, no citoesqueleto e adesão celular. Neste trabalho estudámos a função normal da ATXN3 em neurónios, usando uma nova abordagem com uma linha neuronal SY5Y de neuroblastoma. Caracterizámos as diferentes linhas celulares, nomeadamente diferenciação celular e sobrevida, morfologia, propriedades de adesão e citoesqueleto em células sobreexpressando a estirpe selvagem da ATXN3 (ATXN3_28Q), a forma expandida (ATXN3_83Q) assim como células sobre-expressando uma versão catalítica mutante (ATXN3_C14A) desta proteína. Avaliámos as diferenças na expressão transcripcional e proteica entre as linhas celulares e investigámos quais as vias de sinalização envolvidas nas alterações celulares observadas e reguladores do citoesqueleto. As células sobre-expressando ambas as formas mutante e expandida, da proteína apresentaram uma expressão diminuída da α5 integrina (ITGA5) bem como uma inibição da actividade desta proteína ao longo da via. As evidências resultantes deste estudo levaram-nos a colocar a hipótese que a actividade DUB da ATXN3 está na base da regulação do fenótipo neuronal e também que a expansão do tracto de poliglutaminas causa uma perda parcial da função da ataxina-3