IL-27-regulated signalling pathways in Angiogenesis-possible role of MAPKinases

Dissertação de mestrado em Genética MolecularAngiogénese é o crescimento de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Sabe-se que é um processo envolvido em várias doenças inflamatórias, sobretudo devido a um desequilíbrio entre factores pro-­ e anti-angiogénicos no tecido inflamado. IL-­27 é uma citocina produzida por células apresentadoras de antigénios, com propriedades pro- e anti-inflamatórias e potencial anti-angiogénico. Os sinalizadores de tradução e ativação de transcrição (STATs) são ativados por citocinas e alguns membros da família estão envolvidos em angiogénese, nomeadamente o STAT1. Quando STAT1 é fosforilado no resíduo de serina é induzida a expressão do factor regulatório de interferão-1 (IRF-­1), pelo que se acredita que IRF-­1 é necessário na angiogénese. Adicionalmente, sabe-se que as proteínas de ligação de guanilato (GBPs), são expressas devido à actividade de STAT1 e IRF-­1. Foi também anteriormente sugerido o envolvimento das MAPKinases na angiogénese patológica, contudo a sua ligação ainda não é clara. Com o objectivo de elucidar o mecanismo molecular na sinalização de IL-­27 em células endoteliais, estudámos o mecanismo de fosforilação de STAT1 no resíduo de serina mediada pela IL-­27, observando-se a consequente proliferação/sobrevivência e migração de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Os dados iniciais demonstraram que IL-­27 leva à fosforilação do resíduo de serina em STAT1 e à expressão de IRF-1 em HUVEC. A inibição de SAPK/JNK reduziu a fosforilação de STAT1 no resíduo de serina, bem como a expressão de IRF-­1, confirmando o envolvimento desta MAPK na fosforilação de serina em STAT1. Adicionalmente, verificou-se que a expressão de GBP1 e GBP2 é estimulada por IL-­27 através da actividade de STAT1 e IRF-1. O papel das GBPs na angiogénese não foi esclarecido, estando a ser alvo de novos estudos. O segundo objectivo desta tese era compreender o efeito biológico de IL-­27. Desta forma, foi realizada a optimização de vários ensaios angiogénicos, in vitro e in vivo. Para o estudo in vitro da ramificação de vasos sanguíneos, a migração de células endoteliais e formação de tubos, foram utilizadas as técnicas “Endothelial Spheroid Angiogenesis Assay” e “Endothelial Tube Formation Assay”. Ambos os métodos optimizados revelaram ser ferramentas importantes para investigar sinalização intracelular, pois permitem a utilização de anticorpos, inibidores ou siRNA. Foi ainda testado o modelo de retina de ratinho, observando-se a redução do número de ramificações de vasos sanguíneos na retina, quando estimulados com IL-­27. Este ensaio revelou resultados preliminares encorajadores. Com este estudo temos agora uma melhor compreensão da sinalização de IL-­27 em células endoteliais e o seu possível efeito biológico na angiogénese. Espera-se ainda contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos para angiogénese patológica. Contudo muitas questões foram levantadas, as quais serão futuramente objeto de estudo.Angiogenesis is the growth of new blood vessels from pre-existing vessels. It is a process known to be involved in many inflammatory diseases, mainly due to imbalance between pro-­ and anti-angiogenic factors in the inflamed tissue. IL-­27, a cytokine produced by antigen-presenting cells with both pro-­ and anti-inflammatory properties, was previously demonstrated to have an anti-­angiogenic potential. The signalling transducers and activators of transcriptions (STATs) are induced by cytokines and some of the family members take part in angiogenesis, namely STAT1. When STAT1 is serine-phosphorylated expression of interferon regulatory factor-­1 (IRF-­1) is induced, proposing IRF-­1 association to angiogenesis. Additionally, is known that the guanilate-binding proteins (GBPs) are expressed due to STAT1 and IRF-­1 activities. Also, it was previously suggested the MAPKinases involvement in pathological angiogenesis, but their connection is still unclear. In order to clarify the molecular mechanism in IL-­27 signalling in endothelial cells, was studied the mechanism of STAT1 serine phosphorylation mediated by IL-­27, detecting subsequent proliferation/survival and migration of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Initial data showed that IL-­27 stimulated STAT1 serine phosphorylation and IRF-1 expression in HUVEC. Inhibition of SAPK/JNK reduced STAT1 serine phosphorylation and expression of IRF-­1, thereby establishing the participation of this MAPK in STAT1 serine phosphorylation. Additionally, we observed that GBP1 and GBP2 expression was stimulated by IL-­27 via STAT1 and IRF-1 activity. GBPs role in angiogenesis is now further explored. The second aim of this thesis was to comprehend the biological effect of IL-­27. Therefore, I started optimization of different in vitro and in vivo angiogenesis assays. To in vitro study of sprouting angiogenesis, migration of endothelial cells as well as tube formation, was used “Endothelial Spheroid Angiogenesis Assay” and “Endothelial Tube Formation Assay”. Both optimized assays are good tools for investigating intracellular signalling since the use of siRNA, inhibitors and antibodies is possible. The mouse Retina assay an in vivo angiogenesis model, showed a reduction in the number of branches in IL-­27 stimulated eyes, providing encouraging preliminary results. This study offered a better understanding of IL-­27 signalling in endothelial cells and possible biological effect in angiogenesis. We hope to contribute for the identification of new therapeutical targets for pathophysiological angiogenesis. However, many new questions have been raised, which we aim to dissolve in the future