Thiol-disulphide oxidoreductases : production, purification and structural analysis of a cold adapted DsbA

Dissertação de mestrado em Molecular GeneticsThiol-disulphide oxidoreductases (DsbAs) are bacterial extra-cytoplasmic enzymes which catalyse oxidative disulphide bond formation (S-S) between the thiol sulphurs (-SH) of cysteine side chains in newly synthesised proteins (Shouldice, et al., 2011). In medicine, the key role of DsbA in catalysing the correct folding of many essential proteins that enable pathogenesis has led to suggestions for this enzyme as a potential antimicrobial drug target (Heras, et al., 2009). DsbA catalyses the correct folding of virulence factors associated with cell adhesion, bacterial mobility and host cell manipulation and hence its inhibition would reduce or impede bacterial pathogenesis. Indeed bacterial infections are a major cause of death in the world and this, in addition to current high levels of antibiotic resistance in many pathogenic bacteria, highlights the urgent need for new validated targets and for the design of new antibacterial agents against these targets. Due to its role in pathogenesis DsbA offers such a target for a new therapeutic approach and a better understanding of this enzyme and its function is of much importance. In the present study a cold adapted DsbA from Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 was studied with the long term aim of better understanding its structure and function relationship. Previous studies of this enzyme made use of non-optimised production and purification procedures and production levels were found to be poor (approximately 50 mg/L) with large losses being noted during purification. Therefore the present study was focused on optimising the shake-flask batch production in E. coli and simplifying and improving the purification protocol for this protein. Furthermore, as an initial step in our quest for a better understanding of this enzyme, a comparative structural analysis (with homologous enzymes) was carried out to identify structural factors which may be important for the low temperature activity of cold-adapted DsbAs. Mutants were then designed and prepared in an attempt to investigate the roles of the observed structural differences. We have shown that the rich medium Terrific broth (TB) with induction during the stationary phase of growth allowed for optimum DsbA production. Interestingly, high production levels were attained even in the absence of induction with IPTG. Optimisation of the purification protocol allowed for the development of a simplified procedure yielding 250 mg of purified protein per litre of production culture (a 5-fold increase on that previously reported) with a reduced DsbA loss during the process. Structural comparisons allowed for the identification of two loop insertions in the cold-adapted enzyme as compared to homologs adapted to higher temperatures and four deletion mutants investigating these insertions have been prepared.As tiol-dissulfito oxidorredutases (DsbAs) são enzimas bacterianas extra citoplasmáticas que catalisam a formação oxidativa de pontes dissulfito (S-S) entre os grupos tióilicos (-SH) das cadeias laterais das cisteínas em proteínas recentemente sintetizadas (Shouldice, et al., 2011). Na medicina, o papel chave da DsbA prende-se com a catálise do correcto rearranjo de muitas proteínas essenciais na patogénese, têm assim surgido sugestões de que esta enzima possa ser um alvo de potenciais drogas antimicrobianas (Heras, et al., 2009). A DsbA é catalisadora do correcto rearranjo de factores de virulência associados à adesão celular, mobilidade bacteriana e manipulação das células hospedeiras. Na verdade, as infecções bacterianas são já a maior causa de morte no mundo e este facto, em junção com o actual alto nível de resistência a antibióticos por parte de várias bactérias patogénicas, enaltece a urgente necessidade tanto de validar novos alvos como de objectivar o desenho de novos agentes antibacterianos que actuem nesses alvos. Devido ao seu papel na patogénese, a DsbA, sendo um possível alvo apresenta-se assim uma nova abordagem terapêutica destacandose a elevada importância de um melhor entendimento desta enzima e da sua função. No presente estudo, foi estudada uma DsbA adaptada ao frio proveniente da bactéria Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 objectivando-se a longo prazo um melhor entendimento da relação entre a sua estrutura e função. Estudos anteriores centrados nesta enzima têm feito uso de processos de produção e purificação não optimizados tendo resultado em baixos níveis de produção (aproximadamente 50 mg/L), com grandes perdas observadas no processo de purificação. Assim sendo, o actual estudo centrou-se tanto na optimização da produção em batch em E. coli como em simplificar e melhorar o protocolo de purificação para esta proteína. Além disso, como parte inicial da nossa investigação focada na obtenção de um melhor entendimento desta enzima, uma comparativa análise estrutural (com enzimas homólogas) foi levada a cabo de modo a identificar os factores estruturais que possam ser importantes na actividade a baixas temperaturas desta DsbA naturalmente adaptada ao frio. Os mutantes foram então desenhados na tentativa de investigar o papel das diferenças estruturais observadas. Demonstrou-se neste estudo que a junção do meio rico Terrific Broth (TB) com indução na fase estacionária de crescimento permitiu um nível óptimo de produção da DsbA. Interessantemente, elevados níveis de produção foram alcançados inclusive na ausência de indução. No entanto, altos níveis de produção foram também observados aquando da indução com 1 mM de IPTG na fase de declínio exponencial. A optimização do protocolo de purificação permitiu o desenvolvimento de um simplificado procedimento, rendendo 250 mg de proteína purificada por litro de cultura d produção (5 vezes mais) com a reduzida perda de proteína ao longo do processo. Comparações estruturais permitiram a identificação de duas inserções em loop’s da enzima adaptada ao frio quando comparada com os homólogos adaptados a temperaturas mais elevadas. Neste sentido, quatro mutantes centrados na investigação desses locais foram concebidos