Identification of the Saccharomyces cerevisiae target of Cetuximab-Erbitux, the anti-EGFR antibody used in the treatment of colorectal cancer

Dissertação de mestrado em Genética MolecularColorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies affecting mankind. CRC cells over-express epidermal growth factor receptor (EGFR), which usually correlates with disease poor prognosis and reduced response to therapy. Hence, several therapeutic agents against EGFR were developed, viz. the monoclonal antibody cetuximab/Erbitux®. Such drug competes with EGFR ligands for binding to L2/III domain, which results in EGFR internalization and subsequent degradation, leading to inhibition of cell growth and angiogenesis, and induction of apoptosis. Yet, cancer patients may display or acquire resistance-inducing mutations in EGFR, as well as in its downstream effectors. These contribute to a significant degree of ineffectiveness of treatment, being one of the most prominent problems in CRC clinical assessment. Given the high degree of conservation of eukaryotic cellular processes, yeast has been a model of choice for research in many human pathologies. In this line, this work aimed at the identification of S. cerevisiae surface target of cetuximab, ultimately seeking for the possible EGFR yeast counterpart. Two different strategies were used: (1) in silico sequence and structure homology search, and (2) immune recognition in a cetuximab-based Western blot. The first approach pointed to proteins from the yeast Sporulation specific family, especially Sps2p and Sps22p. These have some structural resemblance with EGFR leucin-rich L-domains, along with cell-surface localization. Conversely, the Western blot clearly identified the Pdc1p (pyruvate decarboxylase isoform 1) as cetuximab antigen. The subsequent detailed analysis of protein features revealed that Pdc1p, as well as its close homologue Pdc5p, present some similarity with EGFR epitope sequence. Moreover, Pdc and EGFR also present some functional pathway overlapping, more evident in malignantly transformed cells. The recognition of Pdc1/5p as cetuximab antigen, combined with its extracellular localization described before, suggests that Pdc1p may have distinct functions beyond glycolytic catalysis/regulation. The double deletion of Sps and Pdc, and the use of diploid genetic background, will be needed to devise the true existence of growth phenotypes induced by cetuximab. However, this work opens a large window as to future research in novel pathways in yeast, beyond the continued exploration of yeast for the aim of generating a tool for CRC patients’ theranostics.O cancro colo-rectal (CRC) é uma das enfermidades mais comuns no mundo. Células de CRC apresentam sobre-expressão do recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), normalmente associada a um pior prognóstico e uma resposta reduzida à terapia. Desta forma, vários agentes contra EGFR foram desenvolvidos, tal como o anticorpo monoclonal cetuximab/Erbitux®. Este compete com os ligandos do EGFR para o domínio L2/III, resultando na internalização e degradação do EGFR. Isto leva à inibição da proliferação celular e angiogénese e, à indução de apoptose. No entanto, os pacientes com CRC podem ter ou adquirir mutações no EGFR, ou nos efetores da sinalização a jusante, que induzem resistência às opções terapêuticas. Estas situações contribuem para uma significativa ineficácia no tratamento do CRC, tornando-se um dos principais problemas da assistência médica a estes doentes. A elevada conservação de processos celulares eucarióticos tornou a levedura um modelo privilegiado no estudo de muitas patologias humanas. Nesse sentido, este trabalho visou a identificação do alvo do cetuximab em S. cerevisiae, em última instância, contribuindo para uma possível identificação da proteína de levedura correspondente ao EGFR. Foram usadas duas estratégias: (1) procura in silico de homologia de sequência e estrutura e, (2) imunoreconhecimento pelo cetuximab (Western blot). A primeira abordagem apontou para a família de proteínas específicas de esporulação (Sporulation specific), nomeadamente as proteínas Sps2p e Sps22p. Estas apresentam alguma semelhança estrutural com os domínios do EGFR ricos em leucinas (domínios L), além de também serem proteínas da superfície celular. Por outro lado, por Western blot identificou-se a Pdc1p (piruvato descarboxilase isoforma 1) como antigénio do cetuximab. Uma análise detalhada subsequente da composição aminoacídica revelou que a Pdc1p, bem como a sua homóloga Pdc5p, apresentam alguma similaridade com a sequência do epítopo do EGFR. Além disso, Pdc e EGFR também apresentam alguma sobreposição funcional, em particular no que diz respeito ao metabolismo das células malignas. O reconhecimento da Pdc1/5p como antigénio do cetuximab, em combinação com a descrição anterior desta proteína na superfície da célula, sugere que a Pdc1p pode ter outras funções para além do seu papel catalítico e regulador no âmbito da glicólise. Para aceder ao fenótipo que o cetuximab possa induzir no crescimento e viabilidade da levedura serão necessárias deleções duplas dos membros das famílias Sps e Pdc, bem como a utilização de estirpes diplóides de levedura. Apesar disso, e para além de permitir a prossecução do objetivo de transformar a levedura numa ferramenta para teranóstico, o presente trabalho abre uma grande janela na investigação em novas vias de sinalização em levedura