Discrimination cinétique de marqueurs fluorescents réversiblement photocommutables

Multiplexing, i.e. simultaneously imaging tens of chemical species in a cell, is a challenge for quantitative biology. To this aim, two imaging protocols, LIGHTNING and HIGHLIGHT, exploiting the kinetics of rich photocycles including photochemical and thermal steps are introduced and applied to reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs). In LIGHTNING, four characteristic times defining the kinetic signature of an RSFP are extracted from fluorescence evolution in four constant illumination regimes granting access to four independent dynamics. Reduced chemical mechanisms derived for the four illumination regimes qualitatively account for fluorescence evolution. Two RSFPs can be distinguished provided that the distance between their 4-D kinetic signature is larger than a cutoff distance related to experimental accuracy. 20 RSFPs out of the 22 investigated RSFPs are discriminated. In HIGHLIGHT, reversibly photoactivatable fluorophores are submitted to sine-wave illumination. At each harmonics, either the in-phase or the quadrature Fourier amplitude of fluorescence oscillations exhibits a resonance in the space of control parameters formed by the excitation frequency and the mean light intensities. Resonance conditions relating the control parameters and parameters characterizing kinetics are made explicit. Tuning the control parameters to target a given fluorophore optimizes its fluorescence response and nearly eliminates the responses of fluorophores with different kinetic properties. Both protocols have complementary merits. LIGHTNING has a larger discriminatory power and HIGHLIGHT provides better quality images due to lock-inamplification.Le multiplexage ou imagerie simultanée de dizaines d’espèces dans une cellule, est un défi pour la biologie quantitative. Deux protocoles d’imagerie, LIGHTNING et HIGHLIGHT, exploitant la cinétique riche de photocycles comprenant des étapes photochimiques et thermiques, ont été conçus et appliqués à des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables (RSFP). Dans LIGHTNING, 4 temps caractéristiques définissant la signature cinétique d’une RSFP sont extraits de l’évolution de la fluorescence pour 4 conditions d’illumination constante donnant accès à 4 dynamiques indépendantes. Des mécanismes chimiques réduits sont dérivés pour les 4 conditions d’illumination. Deux RSFP sont distinguées si la distance entre leurs signatures cinétiques est plus grande qu’une distance de coupure liée à la précision expérimentale. 20 RSFP parmi les 22 étudiées sont discriminées. Dans HIGHLIGHT, des fluorophores réversiblement photocommutables sont soumis à un éclairement sinusoı̈dal. A chaque harmonique, l’amplitude de Fourier en phase ou en quadrature des oscillations de fluorescence présente une résonance dans l’espace des paramètres de contrôle, fréquence d’excitation et intensités lumineuses moyennes. Des conditions de résonance reliant les paramètres de contrôle et les paramètres caractérisant la cinétique sont explicitées. Le choix des paramètres de contrôle permet d’optimiser la réponse d’un fluorophore tout en éliminant celle des fluorophores de cinétiques différentes. Les deux protocoles ont des mérites complémentaires. LIGHTNING a un pouvoir discriminant plus important et HIGHLIGHT fournit des images de meilleure qualité grâce à une détection synchrone