Marcadores fluorescentes em Sporothrix brasiliensis: uma ferramenta para estudos de interação entre hospedeiro e patógeno

Dissertação de mestrado em Ciências da SaúdeSporotrichosis is considered an emerging health problem, being the world's most prevalent subcutaneous mycosis, occurring on mammal hosts, which facilitates zoonotic transmission. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) is a broadly technique used for both plants and fungus transformation. Here, we report the establishing of an ATMT system for S. brasiliensis, considering different strains of A. tumefaciens and S. brasiliensis and several conditions of co-cultivation. Our results point to 72h of co-cultivation at 26°C, the AGL-1 bacterial strain, and the 2:1 ratio (bacteria:fungi) as ideal conditions for a high number of transformants. In these conditions, we obtained 3179 ± 1171 mutants/co-cultivation. PCR analysis showed that all Hygromycin B resistant clones tested harboured a copy of the HPH gene. FACS analysis showed high mitotic stability of the GFP gene in pGAPDH::GFP mutants. The S. brasiliensis pGAPDH::GFP and pGAPDH::H2A::GFP strains were respectively used to evaluate the phagocytosis index and fungicidal activity,. pGAPDH::GFP cytoplasm expression of GFP allowed a strong fluorescence visualization inside monocytes/macrophages in both microscopic and FACS analysis. The phagocytosis index was 64.25 ± 9.96% at the MOI of one peripheral blood mononuclear cell (PBMC) to five pGAPDH::GFP yeast cells, with two hours of infection. The pGAPDH::H2A::GFP S. brasiliensis strain failed to provide a correlation between loss of fungal viability or fungal death and loss of GFP fluorescence in all fungicidal experiments performed. Furthermore, its GFP fluorescence was not visible upon monocytes/macrophages engulfment in both microscopic and FACS analysis. Our results showed, firstly, an efficient genetic toolbox to create large-scale transformant libraries for S. brasiliensis, and secondly, the possibility to use the pGAPDH::GFP strain in phagocytosis assays without fluorophore stain prior to infection. Together, these results can help provide new insights to better understand the host-pathogen interactions and virulence mechanism for the Sporothrix spp..A esporotricose é um problema de saúde emergente e a micose subcutânea mais prevalente no mundo. Esta doença ocorre em hospedeiros mamíferos, o que facilita a sua transmissão zoonótica. A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) é uma técnica amplamente utilizada para a transformação de plantas e fungos. No presente trabalho, estabelecemos um sistema de ATMT para S. brasiliensis, considerando diferentes estirpes de A. tumefaciens e S. brasiliensis, bem como várias condições de co-cultivo. Os nossos resultados apontam para 72h de co-cultivo a 26°C, a estirpe bacteriana AGL-1 e o rácio de 2:1 (bactérias:fungos) como condições ideais para a obtenção de um elevado número de transformantes. Nestas condições, obtivemos 3179 ± 1171 transformantes/co cultivo. A análise de RT-PCR demostrou a presença de uma cópia do gene HPH. A análise de FACS mostrou alta estabilidade mitótica do gene GFP dos isolados da estirpe pGAPDH::GFP. Os mutantes pGAPDH::GFP e pGAPDH::H2A::GFP de S. brasiliensis foram respetivamente usados para calcular o índice de fagocitose e a atividade fungicida. A expressão citoplasmática de GFP da estirpe de pGAPDH::GFP permitiu uma forte visualização de fluorescência dentro dos monócitos/macrófagos em análises de microscópica e FACS. Relativamente aos mutantes pGAPDH::H2A::GFP S. brasiliensis não foi possível obter uma correlação entre a perda de viabilidade fúngica ou morte fúngica e a perda de fluorescência GFP em todos as experiências realizadas no que diz respeito à avaliação da capacidade fungicida dos monócitos/macrófagos. Para além disso, não foi possível detetar a sua fluorescência GFP após ter sido fagocitado pelos monócitos/macrófagos em análises de microscópica e FACS. Em primeiro lugar, este trabalho permitiu a criação de uma ferramenta genética eficiente para construir bibliotecas de transformantes em larga escala para S. brasiliensis. Em segundo lugar, os nossos resultados demostraram que o mutante pGAPDH::GFP pode ser usado em ensaios de fagocitose sem a necessidade de coloração com fluoróforo antes da infeção. Em soma, os nossos resultados podem ajudar a entender melhor as interações hospedeiro-patógeno e o mecanismo de virulência da Sporothrix spp..Agradeço ao ICVS – Instituto de Ciências da Vida e Saúde pela oportunidade e experiência. E também a Fundação para a Ciência e a Tecnologia pelo apoio financeiro dado a esse estudo - FCT-2022.03348.PTDC - Sporob_SiA: Elucidation of the role of sialidase 1 in the severity of feline sporotrichosis caused by Sporothrix brasiliensis