Asymmetric PDLLA membranes containing Bioglass® for guided tissue regeneration

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Biomateriais, Reabilitação e Biomecânica)In the treatment of periodontal defects, composite and asymmetric membranes might be applied to protect the injured area and simultaneously stimulate distinct tissue regeneration. This work describes the development and characterization of poly(D,L-lactic acid)/Bioglass® (PDLLA/BG) membranes with asymmetric bioactivity, prepared by an adjusted solvent casting method that promoted a non-uniform distribution of the inorganic component along the membrane thickness. We hypothesized that an improvement on structural and osteoconductive properties of the composite membranes would occur by the addition of BG, comparing to the pure PDLLA ones. To test this hypothesis a wide range of assays was performed. In vitro asymmetric bioactive behavior was proved. SEM micrographs revealed the smoothness of pure PDLLA membranes surface contrasting to the homogeneous asperities distribution of BG on the composite membranes bottom side surface, in which was exhibited an apatite layer upon immersion in simulated body fluid. The detection of BG presence was complemented by FT-IR spectra analysis. Owing to the BG microparticles hydrophilicity, an enhancement on swelling ratio would be expected by their incorporation on the membranes. Such result was no significantly visible, which may have been influenced by the weight loss induced through BG dissolution in PBS, and which percentage was consequently statistically higher for PDLLA/BG membranes. Such process is consistent with the abovementioned event of the formation of an apatite layer. The mechanical properties of the membranes were not significantly compromised with the introduction of BG. Revealing that this formulation maintains the necessary integrity for the membranes function. Human bone marrow stromal cells (hBMSC) and human periodontal ligament cells (hPDL) were seeded in osteogenic medium on the membranes surface, such as the ideally cell culture choice for the assessment of biological performance, respectively concerning to alveolar bone and periodontal ligament tissues. SEM observation, DNA content and metabolic activity quantification revealed an improved cell adhesion and proliferation for the PDLLA/BG membranes. A significant enhancement on cell differentiation was further detected by the measurement of APL activity, as well as a promoted mineralization, an extended extracellular matrix (ECM) and calcium nodule formation, suggesting the positive effect of the BG microparticles added. These last results were confirmed by both Ca content measurement and Von Kossa staining assays. Accordingly, from this formulation is expected a higher and even better regeneration of the abovementioned tissues. The results indicate that the proposed asymmetric PDLLA/BG membranes could have potential to be used in guided tissue regeneration therapies or in orthopaedic applications, with improved outcomes.No tratamento de defeitos periodontais, a utilização de membranas compósitas de design assimétrico deve ser aplicada de forma a proteger a área afectada e, simultaneamente, estimular a regeneração de tecidos distintos. Este estudo descreve o desenvolvimento e caracterização de membranas de poli(D,L-ácido láctico) (PDLLA) e biovidro (BG, do comercial Bioglass®) com bioactividade assimétrica, através de um método ajustado de evaporação de solvente que permitiu uma distribuição não-uniforme da componente inorgânica ao longa da espessura da membrana. Hipotetizouse que um melhoramento das propriedades estruturais e osteoconductivas das membranas compósitas ocorreria graças à adição do BG, comparativamente às de PDLLA puro. Para testar esta hipótese, um alargado leque de testes foi aplicado. O carácter bioactivo assimétrico foi comprovado in vitro. Micrografias SEM revelaram a suavidade da superfície das membranas de PDLLA puro, contrastante com a homogénea distribuição de asperidades do BG à superfície da face inferior das membranas compósitas, na qual foi exibida uma camada de apatite, após imersão em SBF. A detecção da presença de BG foi complementada por análise dos espectros FT-IR. Graças à hidrofilicidade do BG, seria de esperar um aumento da razão de dilatação pela sua incorporação nas membranas. Tal não foi visível significativamente, podendo ter sofrido influência da perda de peso que a dissolução do BG em PBS provoca e cuja percentagem, por conseguinte, se revelou estatisticamente superior para as membranas de PDLLA/BG. Este processo é consistente com o evento de formação da camada de apatite, acima mencionado. As propriedades mecânicas das membranas não foram significativamente comprometidas com a introdução do BG. Revelando esta ser uma formulação que mantém a integridade exigida à função da membrana. Células humanas do estroma da medula óssea (hBMSC) e células humanas do ligamento periodontal (hPDL) foram cultivadas em meio osteogénico na superfície das membranas, como sendo a cultura celular ideal para a avaliação da performance biológica, no que respeita a tecidos como osso alveolar e ligamento periodontal, respectivamente. A observação SEM, bem como a quantificação do conteúdo em DNA e da actividade metabólica acusaram adesão e proliferação celular superiores nas membranas de PDLLA/BG. Um melhoramento significativo da diferenciação celular foi ulteriormente detectado por mensuração da actividade ALP, assim como uma promovida mineralização e extensa formação de matriz extra-celular e nódulos cálcicos, sugerindo o efeito positivo da adição do BG, confirmado inclusive por medição do conteúdo em Cálcio e procedimento Von Kossa. De acordo com estes resultados, desta formulação espera-se uma maior e melhor regeneração dos tecidos visados. Os resultados indicam que as membranas assimétricas de PDLLA/BG propostas podem ter potencial êxito se utilizadas em terapias de regeneração guiada de tecidos ou em aplicações ortopédicas