Exploring the biomedical potential of a novel algae origin polysaccharide

Programa Doutoral em Engenharia BiomédicaDuring the past decades, marine organisms have been the focus of considerable attention as potential sources of valuable materials. The sustainable exploitation and valorisation of natural marine resources constitutes a highly attractive and strategic platform for the development of novel biomaterials, with both economic and environmental benefits. In this context, algae are well known to synthesise large quantities of polysaccharides. In fact, algae are well established sources of these particularly interesting molecules, many of which are known for their applicability in the design of biomaterials. Among the three main divisions of macroalgae, green algae remain largely unexploited in the biomedical arena. While the demand for novel materials and technologies increases, so does the amount of research focused on these unexploited marine green algae including its unique polysaccharide ulvan. As research on this polysaccharide evolves towards the study of its potential application in a biomedical context, the definition of effective processing routes becomes rather crucial. The main objective of the herein described work is the development of biomedical applications for this green algae polysaccharide, with the additional advantage of adding value to a quite unexploited biomass. The innovative character lays on the application of traditional methodologies to extract and develop medical devices based on ulvan, a polysaccharide extracted from green algae, which presents a large, but yet untapped biomedical potential In order to attain the proposed objectives and in a first stage, a novel method of polysaccharide extraction from green algae has been designed and the resulting material characterized. The polysaccharide ulvan was obtained from the green algae Ulva by step extraction using hot aqueous solutions and precipitation with organic solvents. However and despite the care that is fundamental in the extraction of any natural material and the robustness of the employed methodologies, variability is frequently associated with natural extracts. Nevertheless, applying a simple extraction and purification methodology it was possible to extract a polysaccharide from green algae without significant changes in the overall structure of the polysaccharide. Extracted ulvan is a non-meltable semi-crystalline polysaccharide with high hygroscopic nature, highly sulphated and rich in ulvanobiuronic acid A and with minor amounts of ulvanobiuronic acid B. In general, ulvan is a high molecular weight polysaccharide, composed of rhamnose, glucuronic acid, xylose, iduronic acid and glucose. Besides physicochemical categorization, toxicity data is regarded as a crucial and fundamental knowledge prior to any advances in the application development of natural derived polymers. In order to evaluate ulvan‟s potential cytotoxic behaviour, standard in vitro cytotoxicity screening assays were performed. Extracted ulvan demonstrated good results in terms of its non-cytotoxicity, comparable to a hyaluronic acid control, which suggests that ulvan can be considered as a non-toxic polysaccharide for the range of concentrations studied. Due to its unique structure and interesting inherent properties, ulvan can be considered as a versatile polymer for different applications in a biomedical context. In order to understand the limits of processability of ulvan extracted from green algae, different polymer processing methodologies were attempted. In a first approach, ulvan membranes envisioned towards applications as a medicated dressing were studied and revealed the potential as drug delivery devices for the envisaged applications as a wound medicated dressing. 3D porous scaffolds are widely used in tissue engineering contexts providing a three dimensional template for cell colonization and neo-tissue formation. In this regard, 3D porous structures based on ulvan were also produced by freeze drying and revealed a remarkable ability to uptake water and increased mechanical performance related with both polysaccharide concentration and cross-linking ratios. These structures are highly porous, interconnected, and undergo non-toxic degradation. At this point it is important to stress that ulvan is a polysaccharide soluble in water and prone to hydrolytic degradation, hence a modification step is necessary to render ulvan structures insoluble in water and stable at physiological conditions. Cross-linking with 1,4- butanediol diglycidyl ether (BDDE), a frequently used cross-linker for biomedical applications, was the chosen method to modify ulvan in order to produce both ulvan membranes and 3D porous structures. This cross-linking agent demonstrated to be successful in the cross-linking of this polysaccharide. Besides membranes and 3D porous structures, ulvan particles were developed by extrusion-dripping method and incorporated within a in a poly-D, L-lactic acid matrix in order to produce a novel scaffold with appropriate physicochemical and cytocompatible features to be used in bone engineering. The knowledge gathered during this work encompass necessary and crucial steps to uncover the innovative biomedical potential of the marine derived polysaccharide ulvan, since the design of extraction methodologies from green algae to the study of diverse processing routes focused on the development of structures envisaged for specific biomedical applications.Organismos marinhos têm sido alvo de considerável atenção como potenciais fontes de materiais de elevado valor económico e tecnológico. A exploração sustentável e valorização de recursos marinhos constitui uma plataforma estratégica para o desenvolvimento de novos materiais, com benefícios tanto económicos como ambientais. Neste contexto, as algas sintetizam diferentes polissacáridos, muitos dos quais são conhecidos pela sua aplicabilidade no desenvolvimento de biomateriais para aplicação biomédica. Entre as principais divisões de macroalgas, as algas verdes permanecem largamente inexploradas nesta área. Enquanto a procura de novos materiais e tecnologias aumenta, o mesmo acontece com o estudo sobre algas verdes, em particular sobre o polissacárido ulvano. Há medida que o conhecimento sobre este polissacárido evolui no sentido do seu potencial de aplicação na área biomédica, a descrição de metodologias de processamento eficazes torna-se crucial. Assim, o principal objectivo do presente trabalho centra-se no desenvolvimento da aplicabilidade deste polissacarídeo extraído de algas verdes na área biomédica, com a vantagem suplementar de adicionar valor a um recurso marinho bastante inexplorado. O carácter inovador deste trabalho reside na aplicação de metodologias tradicionais para extrair e desenvolver dispositivos médicos com base em ulvano, que apresenta elevado, mas também insondado potencial biomédico.Para atingir os objectivos aqui propostos e, numa primeira fase, um novo método de extracção de ulvano de algas verdes será desenvolvido e o material resultante será caracterizado. O polissacárido ulvano foi obtido a partir da alga verde Ulva por extracção com soluções aquosas a quente e precipitação com solventes orgânicos. No entanto, e apesar do cuidado que é fundamental na extracção de qualquer material de origem natural e da robustez das metodologias aplicadas, a variabilidade está frequentemente associada a extractos naturais. Ainda assim, a aplicação de metodologias de extracção e purificação simples permitiu a obtenção de um polissacárido com características interessantes sem alterações significativas na estrutura geral do polímero. O ulvano extraído é um polissacárido semi-cristalino, sem ponto de fusão detectado, com uma natureza higroscópica, rico em grupos sulfato e em ácido ulvanobiurónico A, com pequenas quantidades de ácido ulvanobiurónico B. Em geral, é um polissacárido de elevado peso molecular, constituído por ramnose, ácido glucurónico, xilose, ácido idurónico e glucose. Além do estudo da estrutura, composição e propriedades físico-químicas, é necessário um estudo relativo à toxicidade deste polissacárido, considerado como um conhecimento fundamental anterior a qualquer avanço no seu desenvolvimento aplicativo. Neste sentido, ensaios padronizados de toxicidade foram efectuados e o ulvano demonstrou bons resultados em termos de citotoxicidade, comparável ao ácido hialurónico, o que sugere que pode ser considerado como não tóxico, nas condições estudadas. Devido à sua estrutura e propriedades, o ulvano poderá ser utilizado como um polímero versátil para diferentes aplicações num contexto biomédico. A fim de compreender os limites de processamento deste polissacárido, foram testadas diferentes metodologias de processamento de polímeros. Numa primeira abordagem, foram estudadas e confirmadas as propriedades filmogénicas deste polissacárido, com o objectivo de caracterizar a aplicabilidade de membranas de ulvano capazes de funcionar como sistemas de libertação de fármacos. Estruturas porosas são amplamente utilizadas em contextos de engenharia de tecidos fornecendo um modelo tridimensional para a colonização de células e formação de tecidos. Neste contexto, foram também produzidas estruturas porosas com base em ulvano, por liofilização, caracterizadas por uma morfologia porosa, com uma notável capacidade de absorção de água, propriedades mecânicas influenciadas tanto pela concentração do polissacárido como pela quantidade de agente reticulante utilizada e degradação não citotóxica. Neste ponto é importante realçar que o facto de este ser um polissacárido solúvel em água e susceptível a degradação por hidrólise, torna necessária uma etapa de modificação para tornar as estruturas produzidas à base de ulvano insolúveis em água e estáveis em condições fisiológicas. No presente trabalho, foi seleccionada a reticulação com um agente époxido como método passível de modificar o ulvano; este procedimento foi utilizado tanto na produção de membranas como de estruturas porosas aqui descritas. O uso deste agente, frequentemente utilizado em aplicações biomédicas, farmacêuticas ou cosméticas, demonstrou ser bem sucedido na modificação química por reticulação do ulvano. Além de membranas e estruturas porosas, foram desenvolvidas partículas à base de ulvano e incorporadas numa matriz de ácido poli- D, L-láctico, com o objectivo de desenvolver uma estrutura com características apropriadas para aplicações num contexto de engenharia de tecidos. O conhecimento reunido durante a execução desta tese representa um passo necessário e fundamental para revelar a aplicabilidade biomédica do ulvano, desde a elaboração de metodologias de extração de algas verdes até ao estudo de diferentes métodos de processamento, focado no desenvolvimento de estruturas específicas previstas para aplicações biomédicas